3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
2.4.3. Phương pháp thử độc lực trên chuột nhắt trắng
Sau khi nuôi cấy và tiến hành tinh khiết vi khuẩn qua các môi trường
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
trong tủ ấm 37o
C trong 24 giờ tạo điều kiện cho vi khuẩn sản sinh độc tố rồi tiến hành thử độc lực trên chuột thí nghiệm .
Chuẩn bị chuột thí nghiệm : Chuột bạch 18 - 22g/con. Đánh dấu thứ tự
tương ứng với canh khuẩn đem tiêm . Mỗi chủng dùng 2 chuột, mỗi chuột
tiêm 0,2ml canh khuẩn nguyên (đã bồi dưỡng ở 370C trong 24 giờ), tiêm vào
xoang phúc mạc . Theo dõi số chuột chết và thời g ian chết của chuột sau khi tiêm canh khuẩn (trong thời gian 24 – 72 giờ).
Chuột chết được mổ khám kiểm tra bệnh tích , lấy bệnh phẩm ở gan ,
máu tim để phân lập lại .
2.4.4. Phương pháp thử kháng sinh đồ
Chuẩn bị canh khuẩn : Sau khi tiến hành giám định các đặc tính sinh
vật học, lấy mỗi chủng P. multocida đã phân lập được cấy trên môi trường
BHI và bồi dưỡng trong tủ ấm 370
C/24h.
Môi trường sử dụng: Muller Hinton agar.
Tiến hành thử kháng sinh đồ : Lấy 0,5ml canh khuẩn đã chuẩn bị ở trên
pha loãng đến hiệu giá 10-4
. Dùng pipetman hút 0,2ml canh khuẩn đã pha nhỏ
lên đĩa thạch và láng đều trên mặt đĩa thạch , sau đó để 3 - 5 phút cho khô .
Dùng panh đặt và ấn nhẹ các giấy tẩm kháng sinh lên mặt t hạch đặt cách nhau
20 mm, bồi dưỡng trong tủ ấm 370C. Đọc kết quả sau 18 – 24 giờ bằng cách đo
đường kính vòng vô khuẩn và căn cứ vào tiêu chuẩn đánh giá của hãng để đánh giá tính mẫn cảm (Theo Phương pháp Kirby - Bauer, 1966) [37].
2.4.5. Chế tạo vắc xin tại chỗ theo tiêu chuẩn ngành
2.4.5.1. Phương pháp tính LD50 của P. multocida trên chuột
Xác định LD50 theo Reed L. J., Muench H. (1938) [72].
Cách tiến hành: Canh trùng P. multocida pha loãng hệ số 10, mỗi
nồng độ tiêm 5 chuột với liều tiêm là 0,2ml canh trùng/1 con ở các nồng độ pha loãng khác nhau, tính số chuột sống và số chuột chết theo phương pháp cộng dồn.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Tính kết quả theo công thức của Reed Muench:
a - 50
LgLD50= lgA + --- x d
a – b
Trong đó:
A: Là nồng độ pha loãng gây chết sát trên 50% a: Là tỷ lệ chết do liều A gây ra (%)
b: Là tỷ lệ chết do liều B gây ra (%)
B: Là nồng độ pha loãng gây chết sát dưới 50%. d: Là hệ số pha loãng
2.4.5.2. Phương pháp xác định số lượng vi khuẩn
Đếm số vi khuẩn: Theo phương pháp pha loãng đếm khuẩn lạc trên
thạch đĩa. Cấy giống vi khuẩn P. multocida vào môi trường nước thịt, bồi
dưỡng tủ ấm 37°C/24h. Sau đó, canh khuẩn này được pha loãng theo hệ số
10, từ 10-1
đến 10-9. Dùng độ pha loãng 10-6
, 10-7, 10-8, cấy 0,1ml canh trùng ở
mỗi nồng độ lên thạch máu, mỗi độ pha loãng cấy trên 2 đĩa, bồi dưỡng ở 37°C/24h. Đếm số khuẩn lạc mọc.
Số lượng vi khuẩn/1 ml canh trùng được tính bằng công thức: X = a × N × 10
Trong đó:
X: Số lượng vi khuẩn trong 1ml canh khuẩn N: Hệ số pha loãng
a: Số khuẩn lạc ở mỗi nồng độ pha loãng
2.4.5.3. Phương pháp chế tạo vắc xin
Chế tạo vắc xin chết toàn khuẩn có chất bổ trợ theo phương pháp thường qui như sơ đồ sau:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 2.3. Sơ đồ chế tạo vắc xin
Giống vi khuẩn chọn sản xuất vắc xin (CB6) được cấy trên thạch máu, bồi dưỡng ở 37°C/20h
Cấy giống vi khuẩn sản xuất vắc xin vào bình môi trường sản xuất vắc xin, nuôi cấy trong môi trường tĩnh 37°C/24h
Đếm số lượng vi khuẩn trong 1ml canh trùng
Kiểm tra thuần khiết trên các loại môi trường và làm tiêu bản nhuộm
Diệt khuẩn bằng formol nồng độ 0,3% để ở 37°C/21 ngày (Bán thành phẩm)
Kiểm tra vô trùng trên thạch máu, nước thịt yếm khí, thạch thường, thạch nấm
Ra chai thành phẩm
Tập trung vào bình có keo phèn tỷ lệ 20%, lắc đều
Kiểm tra vắc xin
(Theo quy trình kỹ thuật kiểm nghiệm vắc xin dùng trong thú y, 1994[29])
An toàn trên chuột và trâu, bò
Vô trùng như kiểm tra bán thành phẩm
Hiệu lực trên chuột bạch
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.4.6. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu thu được từ kết quả nghiên cứu sẽ được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học , trên phần mềm Minitab và máy tính cá nhân với các thông số thống kê (Chu Văn Mẫn, 2001) [18].
Các công thức sử dụng :
Tỷ lệ mắc bệnh (%) =
Số gia súc mắc bệnh đó ở địa phương đó
x 100
số gia súc đó có ở địa phương đó
Tỷ lệ chết (%) =
Số gia súc chết
x 100
số gia súc mắc bệnh
Tỷ lệ mẫu dương tính (%) =
Số mẫu dương tính
x 100
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Chƣơng 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Kết quả khảo sát tình hình bệnh tụ huyết trùng gia súc tại Cao Bằng từ năm 2006 – 2009 từ năm 2006 – 2009
Bản đồ dịch tễ bệnh tụ huyết trùng trâu, bò trên địa bàn tỉnh Cao Bằng Tỷ lệ 1:350000
Huyện có dịch năm 2006 Huyện có dịch năm 2008
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
3.1.1. Tình hình bệnh tụ huyết trùng tại tỉnh Cao Bằng từ năm 2006 – 2009
Thời tiết của tỉnh Cao Bằng có sự biến động lớn về nhiệt độ và độ ẩm, rõ nhất là giữa hai mùa là mùa mưa và mùa khô hanh. Mùa mưa kéo dài từ tháng 4 đến hết tháng 9, đặc biệt mưa bão tập trung từ tháng 5 đến tháng 8 là
điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn P. multocida tồn tại và phát triển.
Việc xác định số trâu, bò ốm và chết do bệnh tụ huyết trùng hàng năm, mùa phát bệnh và ảnh hưởng của khí hậu thời tiết tới sự phát sinh và lây lan bệnh tụ huyết trùng trâu, bò ở Cao Bằng là cơ sở khoa học để chủ động đề ra các biện pháp phòng chống bệnh hiệu quả tiến tới thanh toán bệnh. Để thực hiện được mục đích trên, từ năm 2006 – 2009 dựa trên các phương pháp nghiên cứu dịch tễ học, quan sát triệu chứng và các số liệu lưu trữ của Chi cục Thú y, chúng tôi tiến hành điều tra số trâu, bò mắc bệnh tụ huyết trùng và chết
trên địa bàn tỉnh (riêng số liệu năm 2009 là của 6 tháng đầu năm). Kết quả
được tổng hợp ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát tình hình bệnh tụ huyết trùng gia súc tại Cao Bằng từ năm 2006 – 2009 Thời gian (năm) Tổng số trâu, bò Tình hình mắc bệnh tụ huyết trùng ốm % chết %* 2006 239.002 713 0,30 169 23,70 2007 246.816 1.231 0,49 243 19,74 2008 254.906 815 0,31 455 55,82 2009 (6 tháng) 230.756 449 0,19 212 47,21 Tính chung 971.480 3.208 0,33 1.079 33,63 %*: Chết so với số ốm
Từ bảng 3.1, các kết quả thu được cho thấy: Tại Cao Bằng, trong khoảng thời gian này (3,5 năm), tỷ lệ trâu, bò mắc bệnh tụ huyết trùng là khá cao. Đã có tới 3.208 con mắc bệnh chiếm tỷ lệ 0,33 % so với tổng đàn và 1.079 con chết chiếm tỷ lệ 33,63% so với số trâu, bò ốm.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Tỷ lệ mắc bệnh ở trâu, bò mà chúng tôi điều tra thấp hơn tỷ lệ mắc bệnh ở trâu, bò của tác giả Bùi Văn Dũng (2000) [2] khi nghiên cứu về bệnh tụ huyết trùng trâu, bò ở Lai Châu (0,63%) và kết quả của Nguyễn Đình Trọng (2002) [33] khi điều tra tại tỉnh Bắc Kạn (0,77%). Song lại cao hơn kết quả của Cao Văn Hồng (2002) [8] điều tra ở Đăk Lăk (0,18%). Sở dĩ có sự khác biệt này theo chúng tôi là do ngoài yếu tố vùng địa lý, tập quán chăn nuôi, tỷ lệ tiêm phòng khác nhau còn do mục đích sử dụng gia súc ở mỗi vùng là khác nhau. Cũng giống như ở Lai Châu, Bắc Cạn và một số vùng núi phía Bắc Việt Nam, tại Cao Bằng trâu, bò được nuôi với mục đích chủ yếu là để sử dụng sức kéo cho nông nghiệp và vận chuyển do đó thường gặp các yếu tố stress do ảnh hưởng của sự thay đổi thời tiết, áp lực công tác cày kéo nặng nề của mùa vụ, còn ở Đăk Lăk trâu, bò được nuôi với mục đích lấy thịt và làm tài sản phục vụ cúng bái là chính do vậy mà tỷ lệ mắc bệnh ở đây thấp hơn.
Tỷ lệ mắc bệnh tụ huyết trùng so với tổng đàn của năm 2007 là cao nhất trong các năm (0,49%). Điều này được giải thích là do mùa đông năm 2007 tỉnh Cao Bằng là khu vực chịu ảnh hưởng mạnh của đợt rét đậm rét hại kéo dài. Trâu, bò vừa bị rét vừa thiếu thức ăn nên tạo điều kiện cho dịch bệnh tụ huyết trùng lan rộng gây thiệt hại lớn.
Qua các số liệu trên cho thấy bệnh tụ huyết trùng xảy ra khá phổ biến và vẫn là mối đe doạ cho ngành chăn nuôi của tỉnh.
3.1.2. Tần suất xuất hiện dịch bệnh tụ huyết trùng tại tỉnh Cao Bằng từ năm 2006 – 2009 năm 2006 – 2009
Đối với các bệnh truyền nhiễm nói chung thì các hiểu biết về khu vực phân bố của bệnh là một yêu cầu cần thiết cho công tác quản lý cũng như theo dõi tình hình dịch bệnh. Theo nhiều tác giả thì bệnh tụ huyết trùng trâu, bò là một bệnh có tính địa phương rất đặc trưng. Vì vậy việc xác định tần số xuất
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
hiện dịch tụ huyết trùng trâu, bò tại các địa phương ở Cao Bằng cũng là một đòi hỏi phục vụ cho công tác phòng chống bệnh.
Tần suất xuất hiện dịch bệnh tụ huyết trùng tại các huyện thị của tỉnh Cao Bằng đã được chúng tôi thống kê từ năm 2006 – 2009. Sau khi xử lý, các kết quả được trình bày ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Tần suất xuất hiện dịch bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại tỉnh Cao Bằng từ năm 2006 - 2009 Thời gian (năm) Tổng số huyện Dịch bệnh tụ huyết trùng trâu, bò Số huyện có dịch Tỷ lệ (%) 2006 13 9 69,23 2007 13 13 100 2008 13 10 76.92 2009 (6 tháng) 13 8 61,54 x X ± m 10 1,24
Từ bảng 3.2, các kết quả thu được cho thấy: Qua các năm điều tra, dịch bệnh tụ huyết trùng xảy ra ở hầu hết các năm, các huyện, thị của tỉnh Cao Bằng song mức độ bùng phát dịch bệnh theo các năm là khác nhau. Trong 4 năm 2006 – 2009 thì năm 2007 là năm có dịch bệnh nổ ra ở 13/13 huyện thị của tỉnh. Năm 2009 là năm có dịch bùng phát theo diện rộng là ít nhất (8/13 huyện, thị), tuy nhiên đây mới chỉ là số liệu điều tra 6 tháng đầu năm. Mặc dù vậy thì tỷ lệ tính chung mức độ bùng phát dịch bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại Cao Bằng là rất mạnh (trung bình 10/13 huyện, thị).
Kết quả này được giải thích do Cao Bằng là một tỉnh miền núi khó khăn, chăn nuôi chủ yếu là quảng canh (trâu, bò thả trên rừng tự kiếm ăn); Người dân lại có tập quán nhốt chung trâu, bò, lợn, gà…với nhau; Sự nhận
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
thức được vai trò của tiêm phòng còn thấp, khi dịch xảy ra thì hệ thống thú y thôn bản có số lượng ít, trình độ cũng như kinh nghiệm yếu kém, giao thông đi lại khó khăn nên khi tới được ổ dịch thì đã quá muộn. Mặt khác, tỉnh có đường biên giới dài với Trung Quốc (có 9/13 huyện giáp biên), hầu hết các huyện đều có giao thương buôn bán hàng hoá qua biên giới trong đó có hàng động vật và sản phẩm động vật. Tình trạng nhập lậu, vận chuyển lậu động vật thường xuyên diễn ra qua các đường mòn các xã giáp biên. Vì vậy khi trâu, bò chết thường không được báo cáo để tiêu hủy mà được tẩu tán qua biên giới. Ngược lại trâu, bò không rõ nguồn gốc xuất xứ được nhập vào Cao Bằng không qua kiểm dịch nên dịch nổ ra thường xuyên và phức tạp. Vì vậy, việc nâng cao chất lượng cán bộ thú y địa phương cũng như nâng cao tuyên truyền hiểu biết về bệnh cho nhân dân là một yêu cầu cấp thiết để có thể khống chế sự lây lan của bệnh và tiến tới khống chế bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại Cao Bằng.
3.1.3. Tỷ lệ trâu, bò ốm và chết do bệnh tụ huyết trùng ở các mùa vụ
Khí hậu của các tỉnh miền núi phía Bắc thường chia làm 2 mùa vụ rõ rệt là vụ Hè – Thu từ tháng 4 đến tháng 10 và Đông – Xuân từ tháng 11 đến tháng 3 năm sau. Sự thay đổi và tác động của điều kiện thời tiết, khí hậu mà trong đó nhân tố cơ bản là ẩm độ và nhiệt độ môi trường gây ra những biến đổi cho cơ thể động vật, gây ra stress làm giảm sức đề kháng của gia súc và tăng khả năng mắc bệnh, trong đó có bệnh tụ huyết trùng. Để nghiên cứu tính chất mùa vụ có ảnh hưởng như thế nào đến việc phát sinh và gây chết vì bệnh tụ huyết trùng, chúng tôi đã điều tra số trâu, bò ốm chết vì bệnh tụ huyết trùng trong 3 năm, kết quả được trình bày ở bảng 3.3.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 3.3. Tỷ lệ trâu, bò ốm và chết do bệnh tụ huyết trùng ở các mùa vụ
Thời gian (năm) Tổng số trâu, bò Số con ốm Số con chết
Đông - Xuân Hè - Thu Đông - Xuân Hè - Thu
Số ốm Tỷ lệ (%) Số ốm Tỷ lệ (%) Số chết Tỷ lệ (%)* Số chết Tỷ lệ (%)* 2006 239.002 142 0,06 571 0,24 43 30,28 126 22,07 2007 246.816 381 0,15 850 0,34 69 18,11 174 20,47 2008 254.906 187 0,07 628 0,25 92 49,2 363 57,8 Tính chung 740.724 710 0,09 2.049 0,28 204 28,73 663 32,36 Tỷ lệ (%)*: Chết so với số ốm
Từ bảng 3.3, các kết quả thu được cho thấy, với tổng số 740.724 trâu, bò điều tra trong vụ Đông – Xuân có 710 con mắc bệnh chiếm 0,09%, số con chết là 204 con, chiếm 28,73% so với số ốm. Vụ Hè – Thu có 2.049 con mắc bệnh, chiếm 0,28%, số con chết là 663 con, chiếm 32,36% so với số ốm.
Như vậy, tỷ lệ mắc bệnh trung bình tại tỉnh Cao Bằng trong vụ Hè – Thu cao hơn vụ Đông – Xuân (P<0,05). Tỷ lệ chết trung bình của bệnh trong vụ Hè – Thu cũng cao hơn vụ Đông – Xuân, tuy nhiên sự sai khác này là không đáng kể (P>0,05). Điều này hoàn toàn phù hợp với quy luật gây bệnh của vi
khuẩn P. multocida và quy luật dịch tễ của bệnh, là vì trong vụ Hè – Thu:
- Thời tiết nóng ẩm, mưa nhiều, bão lụt… thích hợp cho sự phát triển của mầm bệnh và làm giảm sức đề kháng của trâu, bò.
- Trâu, bò thường được thả rông trên đồi rừng, nhiều khi trâu, bò chết mà chủ nuôi không biết hoặc xác chết bị vứt ra sông suối nên khi gặp mưa rào, lụt lội phân và nước tiểu có chứa mầm bệnh có điều kiện lây lan rộng ra
các vùng xung quanh. Ngược lại, do vi khuẩn P. multocida thường cư trú ở
đường hô hấp trên nên ở vụ Đông – Xuân điều kiện khí hậu khắc nghiệt, thức ăn khan hiếm kết hợp với điều kiện chăm sóc nuôi dưỡng kém nên sức đề
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
kháng của trâu, bò giảm vì vậy bệnh cũng có điều kiện phát sinh song không bằng vụ Hè – Thu. Đặc biệt là năm 2007 xảy ra đợt rét lịch sử, nên vào vụ này tuy tỷ lệ mắc bệnh tụ huyết trùng không cao bằng vụ Hè – Thu nhưng tỷ lệ