3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
2.4.2.Phương pháp nuôi cấy, phân lập và xác định vi khuẩn P multocida
Hình 2.1. Sơ đồ phân loại nhóm vi khuẩn gây bệnh theo tính chất sinh vật học (Nguồn: Quinn P. J. và cs (1994) [70]
Dựa trên sơ đồ phân loại nhóm vi khuẩn gây bệnh theo tính chất sinh
vật học, chúng tôi tiến hành phân lập vi khuẩn Pasteurella multocida theo các
bước sau.
2.4.2.1. Nuôi cấy, phân lập
* Phương pháp lấy mẫu: Lấy dịch ngoáy mũi trâu , bò khoẻ.
Gram (+) Gram (-)
Hình cầu MacConkey agar (+)
Ngắn Catalase (-) Oxydase (+) Oxydase (+) Oxydase (-) Catalase (+) Staphylococcus Streptococcus Pseudomonas E. coli Salmonella Poteus Loại khác Pasteurella Moraxella Corynebacterium Erysipelothrix Listeria
Vi khuẩn trên môi trường thạch máu
Dài Oxydase (-) MacConkey agar (-) Hình gậy Bacillus (Clostridium) (Haemophilus) (Brucella)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Dùng que đầu quấn bông thấm đã được vô trùng ngoáy sâu vào mũi của trâu bò , lợn để thấm dị ch tiết của mũi , rồi cho que bông vào ống nghiệm có chứa nước muối sinh lý 0,9% đã hấp vô trùng, đậy nút, ghi nhãn đánh số thứ tự, đưa nhanh về phò ng thí nghiệm (mẫu được cho vào phích lạnh khi vận chuyển). Sau khi mang về phòng thí nghiệm, mẫu được bảo quản trong tủ
lạnh ở 40
C.
* Nuôi cấy phân lập:
Mẫu sau khi thu thập về được ria cấy trên các môi trường nuôi cấy
thông thường và đặc biệt như : Môi trường thạch máu , thạch MacConkey ,
thạch thường , môi trường nước thịt. Môi trường đã cấy vi khuẩn được bồi
dưỡng trong tủ ấm 370
C trong 24 giờ. Sau khi vi khuẩn mọc , căn cứ vào tính
chất mọc trên các môi trường để chọn các khuẩn lạc điển hình của P.
multocida, sau đó lại nuôi cấy trên các môi trường để chọn lọc cho thuần
khiết rồi tiến hành các phương pháp thử sinh hoá để giám định vi khuẩn.
Khuẩn lạc của P. multocida được chọn lọc theo tiêu chuẩn của Heddleston
(1966) [52], Carter (1984) [44].
2.4.2.2. Phương pháp xác định các đặc tính sinh vật, hóa học
* Kiểm tra hình thái vi khuẩn
+ Tiến hành nhuộm Gram :
- Nhỏ 1 – 2 giọt nước sinh lý lên phiến kính sạch.
- Lấy 1 khuẩn lạc điển hình hoà vào giọt nước trên phiến kính. - Cố định vi khuẩn trên phiến kính bằng ngọn lửa đèn cồn. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Nhuộm bằng dung dịch tím tinh thể, để 1 – 2 phút, đổ phần thuốc nhuộm thừa, rửa bằng nước cất.
- Rửa nhanh bằng cồn 70° (tối đa là 15 giây), sau đó rửa lại bằng nước cất.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Gắn màu bằng dung dịch Lugol, để 1 phút, rửa bằng nước cất.
- Rửa nhanh bằng cồn 70° (tối đa là 15 giây), sau đó rửa lại bằng nước cất. - Nhuộm lại bằng dung dịch đỏ Fuchsine, để 1 – 2 phút, loại bỏ thuốc nhuộm thừa, rửa bằng nước cất.
- Rửa lại bằng nước sạch và để khô.
Tiến hành quan sát dưới kính hiển vi quang học bằng vật kính dầu, độ phóng đại 1000 lần (vật kính 100, thị kính 10x). Thấy vi khuẩn có dạng cầu
trực khuẩn, hai đầu tròn, gram âm, bắt màu đậm ở hai đầu, kích thước nhỏ.
* Phản ứng Oxydase
Phản ứng được tiến hành trên giấy thấm 1% Tetrametyl phenylene
diamine hydrocloride, dùng que cấy vô trùng lấy một khuẩn lạc đã tinh khiết
bôi lên mặt giấy thấm thuốc thử . Nếu sau 30 giây tại vị trí bôi khuẩn lạc
chuyển sang màu tím đen là phản ứng dương tính . Nếu không thấy xuất hiện màu tím đen hoặc không đổi màu là phản ứng âm tính .
* Phản ứng lên men đường
Phản ứng này cho phép kiểm tra tính chất lên men một số loại đường khác nhau của vi khuẩn cần giám định.
Trên nền môi trường dinh dưỡng không đường (Nutrient Broth), bổ sung thêm 1,5ml xanh Bromothymol 1,5% trong cồn, trong 100ml dung dịch. Hấp ướt 110°C trong 30 phút, để nguội đem chia vào các ống nghiệm 1×12cm, mỗi ống 3ml có ống Durham. Khi sử dụng cho thêm vào môi trường 0,2ml dung dịch đường cần kiểm tra đã vô trùng, cấy vi khuẩn vào và bồi dưỡng trong tủ ấm 37°C trong vòng 24 giờ, sau đó đọc kết quả. Phản ứng cho kết quả dương tính khi môi trường chuyển sang màu đỏ cánh sen, kết quả âm tính khi môi trường vẫn giữ nguyên màu sắc ban đầu.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 2.2. Sơ đồ phân lập vi khuẩn Pasteurella multocida
(Quinn P. J. và cs, 1994) [70] Dịch ngoáy mũi
Thạch máu (Blood agar), 370C/24 giờ
Chọn khuẩn lạc điển hình
Kiểm tra đặc tính sinh vật – hóa học
Làm tiêu bản, nhuộm Gram
Kiểm tra hình thái, tính chất bắt màu
Các phản ứng sinh hóa
Oxidase (+), Catalase (+), Indole (+)
Lên men Lactose, Dung huyết
Pasteurella multocida Pasteurella haemolytica
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
* Phản ứng Catalase (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Dùng que cấy lấy khuẩn lạc từ môi trường thạch cho lên một phiến
kính sạch, rồi nhỏ từ 1 – 2 giọt dung dịch H2O2 3 - 5% lên, trộn đều. Nếu thấy
sủi bọt là phản ứng dương tính . Nếu không thấy gì là phản ứng âm tính .
* Phản ứng Indole
Cấy vi khuẩn nghi ngờ vào môi trường Nutrient Broth 370C/24h. Nhỏ
1 - 3 giọt Kovac’s dọc theo thành ống nghiệm . Nếu phản ứng dương tính sẽ xuất hiện một vòng tròn đỏ nổi lên trên bề mặt .
* Phản ứng Urease
Cấy vi khuẩn vào môi trường ure , 370C/24h. Nếu dung dịch có màu
hồng là dương tính , nếu không chuyển màu là phản ứng âm tính .
* Phương pháp xác định type
Xác định type vi khuẩn bằng phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) - multiplex capsular PCR.
Phản ứng gồm có các giai đoạn: Tiền biến tính ở 95˚C/3 phút và 35 chu kỳ nhiệt (biến tính 95˚C/50 giây, ủ bắt cặp 55˚C/50 giây, kéo dài 72˚C/1 phút 25 giây) và giữ ở nhiệt độ 72˚C/8 phút, sau đó chuyển sang giữ ở 4˚C.
Quá trình điện di được thực hiện trên gel agarose 2%, hiệu điện thế 100V trong 30 phút. Gel được nhuộm trong dung dịch EDTA đã bổ sung 1% ethidium bromide. Sau 15 phút, tiến hành đọc kết quả bằng hệ thống Gel-Doc 2000. Các vạch DNA được đánh giá bằng cách so sánh với DNA ladder chuẩn và mẫu đối chứng dương.