3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
1.5.5.Vắc xin tại chỗ (autovaccine)
Vắc xin tại chỗ hay ―autovaccine‖ là vắc xin được chế tạo từ những chủng vi sinh gây bệnh, phân lập tại cơ sở chăn nuôi, vì thế có thể tạo được đáp ứng miễn dịch phù hợp hoàn toàn với chủng vi khuẩn gây bệnh tại cơ sở chăn nuôi, giúp bảo vệ gia súc chống lại nguyên nhân gây bệnh tại chỗ, dễ sản xuất và giá thành thấp.
Vắc xin tại chỗ được sử dụng trong những trường hợp có sự đa dạng kháng nguyên của vi sinh vật gây bệnh, vắc xin thương mại không bảo hộ được đàn gia súc, gia cầm chống được bệnh hoặc trong trường hợp chưa có vắc xin thương mại.
Theo ý kiến của các nhà khoa học, vắc xin sản xuất dùng các chủng phân lập tại địa phương và hạn chế cấy chuyển nhiều lần trên môi trường nhân tạo sẽ có chất lượng tốt hơn.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Chƣơng 2
NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng, thời gian và địa điểm nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng
- Vi khuẩn Pasteurella multocida gây bệnh tụ huyết trùng trâu, bò.
- Trâu, bò khoẻ có mang vi khuẩn Pasteurella multocida nuôi tại một
số huyện có dịch trên địa bàn tỉnh Cao Bằng.
2.1.2. Thời gian và địa điểm
- Thời gian: Từ tháng 7 năm 2009 đến tháng 7 năm 2010.
- Địa điểm: Một số ổ dịch thường xuyên trên địa bàn các huyện Trùng Khánh và Quảng Uyên, tỉnh Cao Bằng; Bộ môn Công nghệ Vi sinh, Viện Khoa học Sự sống – Đại học Thái Nguyên; Chi cục thú y Cao Bằng và Học viện Nông nghiệp Quý Châu, Trung Quốc.
2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Điều tra một số đặc điểm dịch tễ bệnh tụ huyết trùng tại tỉnh Cao Bằng
- Tình hình bệnh tụ huyết trùng tại tỉnh Cao Bằng từ năm 2006 – 2009. - Tần suất xuất hiện dịch bệnh tụ huyết trùng tại tỉnh Cao Bằng từ năm 2006 – 2009.
- Tỷ lệ trâu, bò ốm và chết do bệnh tụ huyết trùng ở các mùa vụ. - Triệu chứng đặc trưng ở trâu, bò mắc bệnh tụ huyết trùng.
2.2.2. Phân lập vi khuẩn P. multocida từ dịch ngoáy mũi gia súc khoẻ
- Thu thập mẫu dịch ngoáy mũi và phân lập vi khuẩn P. multocida.
- Nghiên cứu một số đặc tính sinh vật – hoá học của các chủng P.
multocida phân lập được.
- Xác định type vi khuẩn P. multocida phân lập được.
- Xác định độc lực của các chủng P. multocida phân lập được.
- Thử tính mẫn cảm với kháng sinh và hoá dược của vi khuẩn P.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.2.3. Chế tạo vắc xin tại chỗ phòng bệnh tụ huyết trùng
- Chọn chủng P. multocida chế tạo vắc xin.
- Kiểm nghiệm autovaccine tụ huyết trùng ở trong phòng thí nghiệm. - Thử nghiệm an toàn và hiệu lực của autovaccine ở trong phòng thí nghiệm.
2.3. Vật liệu dùng cho nghiên cứu
2.3.1. Mẫu dùng phân lập vi khuẩn (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Dịch ngoáy mũi lấy từ trâu, bò khoẻ mạnh không có biểu hiện triệu chứng lâm sàng.
2.3.2. Động vật thí nghiệm
- Chuột bạch khoẻ mạnh, có trọng lượng từ 18 – 20 gam/con.
- Trâu, bò khoẻ mạnh, không mắc bệnh tụ huyết trùng và chưa được tiêm phòng vắc xin tụ huyết trùng.
2.3.3. Hóa chất và dụng cụ nghiên cứu
2.3.3.1. Hoá chất dùng để nhuộm Gram
- Dung dịch thuốc nh uộm: Tím Gentian và đỏ Fuchsine . - Cồn Axeton.
- Dung dịch Lugol . - Nước cất
2.3.3.2. Hoá chất dùng để thử phản ứng sinh hoá
- Chất thử cho phản ứng Indol e (dung dịch Kovac’s): 5 gam paramino demethy bezada trộ n với 75 ml cồn butylic hoặc i zoamylie đặt vào nồi đun
cách thuỷ 50 - 600
C. Sau đó cho từ từ từng giọt 25ml HCl đặt để qua đêm đến khi xuất hiện màu vàng .
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Giấy thử Oxidase do Úc sả n xuất : 1% dung dịch tetramenthyip -
phinylane diamine dihydrocloride , để ở nhiệt độ phòng , giấy lọc được cắt
thành giải được nhúng vào dung dịch để khô và giữ ở 400
C. - Các loại đường để thử phản ứng : Glucose, Lactose.
- Giấy thử kháng sinh đồ : Giấy thử kháng sinh đồ của hãng Bio - Rad (Pháp) sản xuất.
2.3.4. Môi trường nuôi cấy, phân lập vi khuẩn
- Môi trường nước thịt. - Môi trường thạch thường. - Môi trường thạch máu .
- Môi trường thạch MacConkey . - Môi trường BHI.
- Môi trường Nutrient broth .
2.3.5. Dụng cụ thí nghiệm
- Các trang thiết bị, máy móc có tại bộ môn Công nghệ Vi sinh – Viện
Khoa học Sự sống – Đại học Thái Nguyên.
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp điều tra dịch tễ
- Điều tra một số đặc điểm dịch tễ theo Nguyễn Như Thanh (2005) [31].
- Tổng hợp số liệu thống kê tình hình dịch bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại Cao Bằng trong 4 năm (2006 - 2009) do chi cục thú y tỉnh Cao Bằng cung cấp theo phương pháp của Quinn P. J. và cs (1994) [70].
Ghi chú: Số liệu tình hình dịch bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại Cao Bằng năm 2009 là của 6 tháng đầu năm. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.4.2. Phương pháp nuôi cấy, phân lập và xác định vi khuẩn P. multocida
Hình 2.1. Sơ đồ phân loại nhóm vi khuẩn gây bệnh theo tính chất sinh vật học (Nguồn: Quinn P. J. và cs (1994) [70]
Dựa trên sơ đồ phân loại nhóm vi khuẩn gây bệnh theo tính chất sinh
vật học, chúng tôi tiến hành phân lập vi khuẩn Pasteurella multocida theo các
bước sau.
2.4.2.1. Nuôi cấy, phân lập
* Phương pháp lấy mẫu: Lấy dịch ngoáy mũi trâu , bò khoẻ.
Gram (+) Gram (-)
Hình cầu MacConkey agar (+)
Ngắn Catalase (-) Oxydase (+) Oxydase (+) Oxydase (-) Catalase (+) Staphylococcus Streptococcus Pseudomonas E. coli Salmonella Poteus Loại khác Pasteurella Moraxella Corynebacterium Erysipelothrix Listeria
Vi khuẩn trên môi trường thạch máu
Dài Oxydase (-) MacConkey agar (-) Hình gậy Bacillus (Clostridium) (Haemophilus) (Brucella)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Dùng que đầu quấn bông thấm đã được vô trùng ngoáy sâu vào mũi của trâu bò , lợn để thấm dị ch tiết của mũi , rồi cho que bông vào ống nghiệm có chứa nước muối sinh lý 0,9% đã hấp vô trùng, đậy nút, ghi nhãn đánh số thứ tự, đưa nhanh về phò ng thí nghiệm (mẫu được cho vào phích lạnh khi vận chuyển). Sau khi mang về phòng thí nghiệm, mẫu được bảo quản trong tủ
lạnh ở 40
C.
* Nuôi cấy phân lập:
Mẫu sau khi thu thập về được ria cấy trên các môi trường nuôi cấy
thông thường và đặc biệt như : Môi trường thạch máu , thạch MacConkey ,
thạch thường , môi trường nước thịt. Môi trường đã cấy vi khuẩn được bồi
dưỡng trong tủ ấm 370
C trong 24 giờ. Sau khi vi khuẩn mọc , căn cứ vào tính
chất mọc trên các môi trường để chọn các khuẩn lạc điển hình của P.
multocida, sau đó lại nuôi cấy trên các môi trường để chọn lọc cho thuần
khiết rồi tiến hành các phương pháp thử sinh hoá để giám định vi khuẩn.
Khuẩn lạc của P. multocida được chọn lọc theo tiêu chuẩn của Heddleston
(1966) [52], Carter (1984) [44].
2.4.2.2. Phương pháp xác định các đặc tính sinh vật, hóa học
* Kiểm tra hình thái vi khuẩn (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Tiến hành nhuộm Gram :
- Nhỏ 1 – 2 giọt nước sinh lý lên phiến kính sạch.
- Lấy 1 khuẩn lạc điển hình hoà vào giọt nước trên phiến kính. - Cố định vi khuẩn trên phiến kính bằng ngọn lửa đèn cồn.
- Nhuộm bằng dung dịch tím tinh thể, để 1 – 2 phút, đổ phần thuốc nhuộm thừa, rửa bằng nước cất.
- Rửa nhanh bằng cồn 70° (tối đa là 15 giây), sau đó rửa lại bằng nước cất.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Gắn màu bằng dung dịch Lugol, để 1 phút, rửa bằng nước cất.
- Rửa nhanh bằng cồn 70° (tối đa là 15 giây), sau đó rửa lại bằng nước cất. - Nhuộm lại bằng dung dịch đỏ Fuchsine, để 1 – 2 phút, loại bỏ thuốc nhuộm thừa, rửa bằng nước cất.
- Rửa lại bằng nước sạch và để khô.
Tiến hành quan sát dưới kính hiển vi quang học bằng vật kính dầu, độ phóng đại 1000 lần (vật kính 100, thị kính 10x). Thấy vi khuẩn có dạng cầu
trực khuẩn, hai đầu tròn, gram âm, bắt màu đậm ở hai đầu, kích thước nhỏ.
* Phản ứng Oxydase
Phản ứng được tiến hành trên giấy thấm 1% Tetrametyl phenylene
diamine hydrocloride, dùng que cấy vô trùng lấy một khuẩn lạc đã tinh khiết
bôi lên mặt giấy thấm thuốc thử . Nếu sau 30 giây tại vị trí bôi khuẩn lạc
chuyển sang màu tím đen là phản ứng dương tính . Nếu không thấy xuất hiện màu tím đen hoặc không đổi màu là phản ứng âm tính .
* Phản ứng lên men đường
Phản ứng này cho phép kiểm tra tính chất lên men một số loại đường khác nhau của vi khuẩn cần giám định.
Trên nền môi trường dinh dưỡng không đường (Nutrient Broth), bổ sung thêm 1,5ml xanh Bromothymol 1,5% trong cồn, trong 100ml dung dịch. Hấp ướt 110°C trong 30 phút, để nguội đem chia vào các ống nghiệm 1×12cm, mỗi ống 3ml có ống Durham. Khi sử dụng cho thêm vào môi trường 0,2ml dung dịch đường cần kiểm tra đã vô trùng, cấy vi khuẩn vào và bồi dưỡng trong tủ ấm 37°C trong vòng 24 giờ, sau đó đọc kết quả. Phản ứng cho kết quả dương tính khi môi trường chuyển sang màu đỏ cánh sen, kết quả âm tính khi môi trường vẫn giữ nguyên màu sắc ban đầu.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 2.2. Sơ đồ phân lập vi khuẩn Pasteurella multocida
(Quinn P. J. và cs, 1994) [70] Dịch ngoáy mũi
Thạch máu (Blood agar), 370C/24 giờ
Chọn khuẩn lạc điển hình
Kiểm tra đặc tính sinh vật – hóa học
Làm tiêu bản, nhuộm Gram
Kiểm tra hình thái, tính chất bắt màu
Các phản ứng sinh hóa
Oxidase (+), Catalase (+), Indole (+)
Lên men Lactose, Dung huyết (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Pasteurella multocida Pasteurella haemolytica
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
* Phản ứng Catalase
Dùng que cấy lấy khuẩn lạc từ môi trường thạch cho lên một phiến
kính sạch, rồi nhỏ từ 1 – 2 giọt dung dịch H2O2 3 - 5% lên, trộn đều. Nếu thấy
sủi bọt là phản ứng dương tính . Nếu không thấy gì là phản ứng âm tính .
* Phản ứng Indole
Cấy vi khuẩn nghi ngờ vào môi trường Nutrient Broth 370C/24h. Nhỏ
1 - 3 giọt Kovac’s dọc theo thành ống nghiệm . Nếu phản ứng dương tính sẽ xuất hiện một vòng tròn đỏ nổi lên trên bề mặt .
* Phản ứng Urease
Cấy vi khuẩn vào môi trường ure , 370C/24h. Nếu dung dịch có màu
hồng là dương tính , nếu không chuyển màu là phản ứng âm tính .
* Phương pháp xác định type
Xác định type vi khuẩn bằng phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) - multiplex capsular PCR.
Phản ứng gồm có các giai đoạn: Tiền biến tính ở 95˚C/3 phút và 35 chu kỳ nhiệt (biến tính 95˚C/50 giây, ủ bắt cặp 55˚C/50 giây, kéo dài 72˚C/1 phút 25 giây) và giữ ở nhiệt độ 72˚C/8 phút, sau đó chuyển sang giữ ở 4˚C.
Quá trình điện di được thực hiện trên gel agarose 2%, hiệu điện thế 100V trong 30 phút. Gel được nhuộm trong dung dịch EDTA đã bổ sung 1% ethidium bromide. Sau 15 phút, tiến hành đọc kết quả bằng hệ thống Gel-Doc 2000. Các vạch DNA được đánh giá bằng cách so sánh với DNA ladder chuẩn và mẫu đối chứng dương.
2.4.3. Phương pháp thử độc lực trên chuột nhắt trắng
Sau khi nuôi cấy và tiến hành tinh khiết vi khuẩn qua các môi trường
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
trong tủ ấm 37o
C trong 24 giờ tạo điều kiện cho vi khuẩn sản sinh độc tố rồi tiến hành thử độc lực trên chuột thí nghiệm .
Chuẩn bị chuột thí nghiệm : Chuột bạch 18 - 22g/con. Đánh dấu thứ tự
tương ứng với canh khuẩn đem tiêm . Mỗi chủng dùng 2 chuột, mỗi chuột
tiêm 0,2ml canh khuẩn nguyên (đã bồi dưỡng ở 370C trong 24 giờ), tiêm vào
xoang phúc mạc . Theo dõi số chuột chết và thời g ian chết của chuột sau khi tiêm canh khuẩn (trong thời gian 24 – 72 giờ).
Chuột chết được mổ khám kiểm tra bệnh tích , lấy bệnh phẩm ở gan ,
máu tim để phân lập lại .
2.4.4. Phương pháp thử kháng sinh đồ
Chuẩn bị canh khuẩn : Sau khi tiến hành giám định các đặc tính sinh
vật học, lấy mỗi chủng P. multocida đã phân lập được cấy trên môi trường (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
BHI và bồi dưỡng trong tủ ấm 370
C/24h.
Môi trường sử dụng: Muller Hinton agar.
Tiến hành thử kháng sinh đồ : Lấy 0,5ml canh khuẩn đã chuẩn bị ở trên
pha loãng đến hiệu giá 10-4
. Dùng pipetman hút 0,2ml canh khuẩn đã pha nhỏ
lên đĩa thạch và láng đều trên mặt đĩa thạch , sau đó để 3 - 5 phút cho khô .
Dùng panh đặt và ấn nhẹ các giấy tẩm kháng sinh lên mặt t hạch đặt cách nhau
20 mm, bồi dưỡng trong tủ ấm 370C. Đọc kết quả sau 18 – 24 giờ bằng cách đo
đường kính vòng vô khuẩn và căn cứ vào tiêu chuẩn đánh giá của hãng để đánh giá tính mẫn cảm (Theo Phương pháp Kirby - Bauer, 1966) [37].
2.4.5. Chế tạo vắc xin tại chỗ theo tiêu chuẩn ngành
2.4.5.1. Phương pháp tính LD50 của P. multocida trên chuột
Xác định LD50 theo Reed L. J., Muench H. (1938) [72].
Cách tiến hành: Canh trùng P. multocida pha loãng hệ số 10, mỗi
nồng độ tiêm 5 chuột với liều tiêm là 0,2ml canh trùng/1 con ở các nồng độ pha loãng khác nhau, tính số chuột sống và số chuột chết theo phương pháp cộng dồn.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Tính kết quả theo công thức của Reed Muench:
a - 50
LgLD50= lgA + --- x d
a – b
Trong đó:
A: Là nồng độ pha loãng gây chết sát trên 50% a: Là tỷ lệ chết do liều A gây ra (%)
b: Là tỷ lệ chết do liều B gây ra (%)
B: Là nồng độ pha loãng gây chết sát dưới 50%. d: Là hệ số pha loãng
2.4.5.2. Phương pháp xác định số lượng vi khuẩn
Đếm số vi khuẩn: Theo phương pháp pha loãng đếm khuẩn lạc trên
thạch đĩa. Cấy giống vi khuẩn P. multocida vào môi trường nước thịt, bồi
dưỡng tủ ấm 37°C/24h. Sau đó, canh khuẩn này được pha loãng theo hệ số
10, từ 10-1
đến 10-9. Dùng độ pha loãng 10-6 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
, 10-7, 10-8, cấy 0,1ml canh trùng ở
mỗi nồng độ lên thạch máu, mỗi độ pha loãng cấy trên 2 đĩa, bồi dưỡng ở 37°C/24h. Đếm số khuẩn lạc mọc.
Số lượng vi khuẩn/1 ml canh trùng được tính bằng công thức: X = a × N × 10
Trong đó:
X: Số lượng vi khuẩn trong 1ml canh khuẩn N: Hệ số pha loãng
a: Số khuẩn lạc ở mỗi nồng độ pha loãng
2.4.5.3. Phương pháp chế tạo vắc xin
Chế tạo vắc xin chết toàn khuẩn có chất bổ trợ theo phương pháp thường qui như sơ đồ sau:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 2.3. Sơ đồ chế tạo vắc xin
Giống vi khuẩn chọn sản xuất vắc xin (CB6) được cấy trên thạch máu, bồi dưỡng ở 37°C/20h
Cấy giống vi khuẩn sản xuất vắc xin vào bình môi trường sản xuất vắc xin, nuôi cấy trong môi trường tĩnh 37°C/24h
Đếm số lượng vi khuẩn trong 1ml canh trùng
Kiểm tra thuần khiết trên các loại môi trường và làm tiêu bản nhuộm
Diệt khuẩn bằng formol nồng độ 0,3% để ở 37°C/21 ngày (Bán thành phẩm)
Kiểm tra vô trùng trên thạch máu, nước thịt yếm khí, thạch thường, thạch nấm
Ra chai thành phẩm
Tập trung vào bình có keo phèn tỷ lệ 20%, lắc đều