người thành đại thực bào
Tách và nuôi cấy thành công bạch cầu đơn nhân từ máu ngoại vi
Các tế bào bạch cầu đơn nhân được tách từ Buffy coat của người bằng ly tâm gradient tỷ trọng với Ficoll 1.077 g/ml. Các tế bào này được chuyển vào đĩa chứa môi trường nuôi cấy để chúng bám dính xuống bề mặt của đĩa nuôi cấy. 2h sau đó chúng tôi rửa để loại bỏ các tế bào không bám dính, bổ sung môi trường mới có bổ sung hGM_CSF với nồng độ 10ng/ml. Chúng tôi thay môi trường 3 ngày một lần, giữ một nửa môi trường cũ và bổ sung thêm một nửa môi trường mới.
Theo dõi sự phát triển của các tế bào này trong quá trình nuôi cấy chúng tôi nhận thấy theo thời gian số lượng tế bào tăng lên rõ rệt, tế bào thay đổi hình dạng và bám rộng trên bề mặt đĩa nuôi cấy. Ở hình 3.8 A và 3.8 C là hình ảnh tế bào bạch cầu đơn nhân ngày đầu tiên sau khi tách từ Buffy coat: số lượng tế bào rất ít, tế bào bám dính không chặt trên bề mặt đĩa. Sau 12 ngày nuôi cấy (hình 3.8 C và 3.8 D)
trong môi trường có bổ sung hGM_CSF ta có thể thấy tế bào đã phủ gần kín bề mặt đĩa nuôi cấy, các tế bào dàn dẹt và bám rất chắc trên bề mặt đĩa. Điều này khẳng định hGM_CSF khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy có khả năng kích thích sự nhân lên và phát triển của các bạch cầu đơn nhân.
3.8A: Bạch cầu đơn nhân khi mới tách
(10x10x5.6)
3.8 B: Bạch cầu đơn nhân sau 12 ngày nuôi cấy (10x10x5.6)
3.8 C: Bạch cầu đơn nhân khi mới tách
(40x10x5.6)
3.8 D: Bạch cầu đơn nhân sau 12 ngày nuôi cấy (40x10x5.6)
Hình 3.8: Sự thay đổi về hình dạng và số lượng của bạch cầu đơn nhân khi nuôi cấy
Biệt hóa bạch cầu đơn nhân tách từ máu ngoại vi thành đại thực bào
Chúng ta có thể xác định sự biệt hóa các bạch cầu đơn nhân thành đại thực bào thông qua sự biểu hiện của một số cụm biệt hóa đặc hiệu với đại thực bào như Cd11b, CD14, CD68. Trong thí nghiệm này chúng tôi xác định sự biệt hóa của bạch cầu đơn nhân thành đại thực bào bằng cách nhuộm miễn dịch huỳnh quang với kháng thể kháng CD14. Tiêu bản được quan sát và chụp ảnh dưới kính hiển vi laser quét LSM 510, kết quả cho thấy gần 100% các bạch cầu đơn nhân sau khi tách và nuôi cấy trong môi trường có bổ sung hGM_CSF đã biệt hóa thành đại thực bào.
3.9 A: 20x, zoom 3.9 B: 63x oil
Hình 3.9: Đại thực bào khi nhuộm đặc hiệu với anti human CD14
CD14: màu đỏ Nhân: màu xanh da trời
Qua hình ảnh ghi lại ở các vật kính 20x và 63x của kính hiển vi LSM 510 chúng ta có thể khẳng định bạch cầu đơn nhân đã được biệt hóa thành đại thực bào, tế bào bắt màu mạnh với thuốc nhuộm đặc hiệu với CD14 (màu đỏ), tế bào dàn rộng có nhiều tua nhánh bám trên bề mặt đĩa. Kết quả này cùng với kết quả nhân nuôi bạch cầu đơn nhân đã nêu ở trên có thể giúp chúng tôi khẳng định một lần nữa là đã tách thành công bạch cầu đơn nhân từ máu ngoại vi của người, đồng thời hGM_CSF khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy với nồng độ 10ng/ml có khả năng kích thích các bạch cầu đơn nhân tăng sinh và biệt hóa thành đại thực bào.
3.3.2. Khả năng nhập các vật liệu nano từ của các đại thực bào a) Khả năng nhập các vật liệu nano từ của đại thực bào tách từ chuột a) Khả năng nhập các vật liệu nano từ của đại thực bào tách từ chuột
Hạt nano từ bọc Chitosan
Sau khi tách 24h, tế bào đã được nuôi ổn định và bám chặt trên bề mặt đĩa nuôi cấy, chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng ăn các hạt nano từ bọc Chitosan (Fe – Cs) vào bên trong của đại thực bào. Ủ đại thực bào của chuột với hạt Fe – Cs với hàm lượng 0,5mg/triệu tế bào. Quan sát và ghi lại hoạt động của đại thực bào cũng như sự thay đổi về màu sắc của đại thực bào cho thấy:
- Sau khi ủ với hạt nano Fe – Cs khoảng 15 phút, đại thực bào bắt đầu hoạt động chúng co tế bào lại và hình thành các chân giả để vơ vét các hạt nano (vật lạ
với tế bào) vào bên trong tế bào. Sau khoảng 30 phút tế bào đã thu được rất nhiều hạt nano vào bên trong. Màu sắc của tế bào thay đổi theo thời gian ủ với hạt nano, thời gian ủ càng lâu thì tế bào càng trở nên sẫm màu hơn (màu của hạt nano Fe – Cs) so với nhóm tế bào đối chư. Một số hình ảnh minh họa sự thay đổi về màu sắc tế bào khi ủ với hạt nano Fe – Cs được đưa ra dưới đây để chứng minh những nhận định trên.
6A 6B 6C
6D 6E 6F
Hình 3.10: Chuyển động của đại thực bào, hình thành chân giả để vơ vét hạt nano Fe – Cs Nhìn vào hình ảnh 3.10 ta có thê thấy từ hình A đến hình F tế bào (đánh dấu mũi tến đen) có rất nhiều tư thế. Ban đầu tế bào có hai chân giả rất lớn, sau đó hai chân này được co ngắn dần tế bào trở nên tròn hơn (hình E) rồi lại tiếp tục hình thành chân giả mới (hình F). Như vậy hoạt động của đại thực bào là rất rõ rệt, chúng liên tục di chuyển và thu nhận hạt nano Fe3O4 – Cs vào bên trong tế bào.
- Không chỉ trạng thái tư thế tế bào thay đổi, màu sắc của tế bào cũng thay đổi chúng trở nên sẫm màu do chứa nhiều hạt nano Fe3O4 – Cs ở bên trong tế bào.
A: Tế bào đối chứng màu sáng (20x10x7.1)
B: Tế bào ủ với hạt Fe – Cs màu sẫm
(20x10x7.1)
C: Tế bào đối chứng màu sáng (40x10x7.1)
D: Tế bào ủ với hạt Fe – Cs màu sẫm
(40x10x7.1)
Hình 3.11: Sự khác biệt về màu sắc giữa nhóm đại thực bào không ủ và có ủ
với hạt nano Fe – Cs
Để khẳng định một cách chắc chắn rằng hạt nano Fe3O4 – Cs đã được đại thực bào thu nhận vào trong chúng tôi tiến hành làm tiêu bản hiển vi điện từ. Sau 24h ủ với hạt Fe3O4 – Cs, đĩa đại thực bào được đem đi chụp dưới kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) để quan sát các cấu trúc bên trong của tế bào. Hình ảnh ghi lại được chúng tôi đưa ra ở hình 8.
A: Đại thực bào ủ với Fe – Cs (2500x)
B: Đại thực bào ủ với Fe – Cs (10000x)
C: Đại thực bào đối chứng (3000x) D: Đại thực bào đối chứng (10000x)
Hình 3.12: Sự khác biệt về cấu trúc bên trong của đại thực bào khi ủ với hạt nano
Fe3O4 – Cs so với tế bào đối chứng
( : Các không bào chứa hạt nano Fe3O4 – Cs ở bên trong)
Ở hình ảnh có độ phóng đại 3000x chúng ta có thể dễ dàng nhìn thấy các tế bào có nhân hình hạt đậu là dạng nhân rất điển hình của đại thực bào và tế bào bạch cầu đơ nhân. Ở tế bào thuộc nhóm có ủ với hạt Fe3O4 – Cs (hình A và B) tế bào hình thành các bóng không bào nhiều hơn hẳn so với tế bào thuộc nhóm đối chứng (C và D). Mặt khác bên trong các không bào này có chứa rất nhiều hạt nano màu sẫm Fe3O4 – Cs. Điều này khẳng định các đại thực bào trong quá trình hoạt động đã
bắt giữ các hạt nano vào bên trong các bóng không bào hay còn gọi là các bóng thực bào.
Hạt nano từ bọc Chitosan có gắn Curcumin
Một kết quả nữa cũng khẳng định rằng đại thực bào tách từ chuột có khả năng thu nhận vật lạ (tác nhân bệnh lý) vào bên trong tế bào khi chúng tôi lợi dụng khả năng phát ánh sáng màu xanh của các hạt nano Fe3O4 – Cs ~ Cur khi chiếu ánh sáng kích thích ở bước sóng 488nm. Hạt Fe3O4 – Cs ~ Cur được ủ chung với đại thực bào được tách từ chuột với hàm lượng 0,5mg/triệu tế bào. Sau 2h ủ, rửa đĩa tế bào bằng PBS để loại bỏ phần hạt nano không được đưa vào trong tế bào sau đó cố dịnh và hành làm tiêu bản miễn dịch huỳnh quang để quan sát.
Hình 3.13: Đại thực bào của chuột khi ủ với hạt nano Fe3O4 – Cs ~ Cur
Hình 3.14: Đại thực bào của chuột khi ủ với hạt Fe3O4 – Cs ~ Cur chụp dưới các kênh ánh sáng khác nhau ở kính hiển vi LSM 510
Ở ánh sáng truyền qua ta thấy tế bào đại thực bào có chứa các bóng không bào rất lớn, tạo ra bề mặt lồi lõm rõ rệt của tế bào. Khi được nhuộm với thuốc nhuộm đặc hiệu với Red Phalloidin đặc hiệu với actin – một protein tham gia vào cấu trúc bộ khung xương của tế bào, hình ảnh thu được cho ta thấy đại thực bào tách đã hình thành rất nhiều các tua (chân giả) bám rộng trên bề mặt đĩa nuôi cấy và bắt giữ các hạt nano vào trong. Các chấm màu xanh nằm trong vùng tế bào chất chính là các cụm hạt nano đã được các đại thực bào thu nhận vào bên trong tế bào. Kêt quả này hoàn toàn phù hợp với kết quả chụp ảnh hiển vi điện tử cũng như hình ảnh khi quan sát dưới kính hiển vi quang học đã nêu ở phía trên. Điều này khẳng định đại thực bào tách từ xoang bụng của chuột Swiss là có hoạt tính, có khả năng thu nhận các tác nhân lạ vào bên trong tế bào.
Hàm lượng hạt nano từ Fe3O4– Ole ~ Curcó trong đại thực bào
Green channel Tranmission light Blue channel
Red channel Merge Tranmission light: ánh
sáng truyền qua
Green channel: Quan sát
được Fe3O4 – Cs ~ Cur
Blue channel: Nhận biết
Nhân tế bào
Red channel: phân bố của
Do hạt nano Fe3O4 – Cs ~ Cur có độ phân tán không tốt trong môi trường nuôi cấy có pH trung tính, chúng tạo thành các đám cụm lớn khiến đại thực bào rất khó thu nhận vào trong. Điều này là một trở ngại cho việc ứng dụng đại thực bào để phân phối tác nhân trị ung thư do chúng không chuyên chở được nhiều. Chính vì lý do này các thuốc sử dụng cho liệu pháp này cần có độ phân tán tốt để đại thực bào có thể mang được nhiều như mong muốn. Do đó chúng tôi chọn loại hạt nano từ bọc axit Oleic có gắn Curcumin để làm thí nghiệm này với mục đích định lượng khả năng thu nhận các hạt nano của đại thực bào theo thời gian. Đại thực bào tách từ chuột được ủ với hạt nano Fe3O4– Ole ~ Cur trong đĩa 24 giếng với hàm lượng 0.5mg/triệu tế bào. Chia làm hai nhóm thí nghiệm: Một nhóm dùng làm tiêu bản huỳnh quang để quan sát đồng thời nhóm còn lại dùng để đo từ dộ nhằm định lượng hạt nano có trong đại thực bào.
Hình 3.15:Độ phân tán của hai loại hạt nano từ
A: Fe3O4 – Cs ~ Cur. B: Fe3O4 – Ole ~ Cur
Quan sát dưới kính hiển vi LSM 510
Đại thực bào sau khi được ủ với hạt nano Fe3O4– Ole ~ Cur được rửa để loại bỏ các hạt nano dư thừa và cố định ở các thời điểm khác nhau là 1h, 2h, 4h và 6h để quan sát. Khi quan sát dưới kính hiển vi ta thấy sự thay đổi về mật độ hạt nano khi cố định tại các thời điểm khác nhau sau khi ủ với hat nano từ.
A: 1h sau khi ủ B: 2h sau khi ủ
C: 4h sau khi ủ D: 6h sau khi ủ
Hình 3.16: Đại thực bào chuột ủ với hạt nano Fe3O4– Ole ~ Cur khi được cố định tại các
thời điểm khác nhau (40 x 1.3 oil x zoom 2 ở kính hiển vi LSM 510)
Actin: đỏ Nhân: Xanh da trời Fe3O4 – Ole ~ Cur: xanh lá cây
Hình 3.16 cho chúng ta thấy khi thời gian ủ tăng lên thì số lượng hạt nano được đại thực bào thu nhận vào trong càng nhiều. Ở thời điểm 1h và 2h sau khi ủ với hạt nano từ, số hạt nano bám phía ngoài tế bào còn nhiều và lượng hạt nano vào hẳn bên trong tế bào ít hơn nhiều so với thời điểm 4h sau khi ủ. Đặc biệt đến thời điểm 6h sau khi ủ các hạt nano đã đi sâu vào trong tế bào với số lượng rất nhiều tập trung ở vùng xung quanh nhân tế bào. Hình thái của đại thực bào tại thời điểm 1 và 2 h cũng khác so với thời điểm thời điểm 4h và 6h sau khi ủ, bộ khung xương của tế bào thay đôi trạng thái. Tại hai thời điểm đầu tế bào bám trên bề mặt đĩa với kích
thước nhỏ hơn, khoảng cách giữa các tế bào khá lớn, trong khi ở hai thời điểm sau tế bào đã dàn rộng bám kín bề mặt đĩa với diện tích tiếp xúc lớn hơn, khoảng cách giữa các tế bào bị thu hẹp lại và đến thời điểm 6h hầu như giữa các tế bào đã không còn khoảng cách. Như vậy thời gian ủ hạt nano từ với đại thực bào thay đổi từ 1h đến 6h thì số lượng hạt nano được đại thực bào thu nhận vào trong ngày càng tăng. Hình 20 khi chụp ở độ phóng đại lớn hơn thêm khẳng định lượng hạt nano có trong đại thực bào là vô cùng nhiều tại thời điểm 6h sau khi ủ chung đại thực bào với hạt Fe3O4– Ole ~ Cur.
Hình 3.17: Tế bào Macrophage được ủ 6h với hạt Fe3O4– Ole ~ Cur
Actin: đỏ Nhân: xanh da trời Hạt Fe3O4– Ole ~ Cur: xanh lá cây (63x 1.3 oil. Zoom 3.7)
Đo từ độ xác định lượng hạt nano từ Fe3O4– Ole ~ Curcó trong đại thực bào
Sau khi ủ đại thực bào với hạt nano Fe3O4– Ole ~ Cur, tại các thời điểm 1h, 2h, 4h và 6h sau khi ủ tế bào được lấy ra rửa sạch bằng PBS để loại đi phần hạt nano dư thừa ở ngoài tế bào, sau đó chuẩn bị 104 tế bào/10µl PBS cho vào các ống mao quản bằng thủy tinh, hàn kín hai đầu ống mao quan rồi đem đo ở máy đo từ độ để xác định hàm lượng từ có trong mẫu tế bào. Kết quả đo từ độ được đưa ra dưới đây.
Bảng 3.5: Bố trí thí nghiệm đo từ độ mẫu đại thực bào ủ với hạt nano từ
Thời gian ủ (h) 1 2 4 6
Kí hiệu mẫu B1 B2 B4 B6
Hình 3.18: Đường cong từ độ của các mẫu tế bào ủ với hạt nano với thời gian khác nhau Nhìn vào hình ảnh ta có thể thấy khi thời gian ủ với hạt nano từ càng lớn thì mẫu đo cho giá trị từ độ càng lớn, lệch ra khỏi trục 0 càng xa. Giá trị từ độ tăng mạnh khi đại thực bào ủ vói hạt nano từ trong khoảng thời gian từ 4h – 6h. Khi thời gian ủ đại thực bào với hạt nano Fe3O4– Ole ~ Cur là 6h thì giá trị từ độ của mẫu tế bào đã lên đến 0,0275emu/g, giá trị này cao hơn rất nhiều so với mẫu ủ 1h chỉ đat 0,0014(emu/g).
Như vậy dựa trên những kết quả về hình ảnh chụp dưới kính hiển vi huỳnh quang và kết quả đo từ độ ta có thể khẳng định rằng thời gian ủ đại thực càng lớn thì lượng hạt nano từ được nhập vào bên trong đại thực bào càng nhiều.
b) Khả năng nhập các hạt nano từ của đại thực bào người
Với những kết quả khảo sát về khả năng thực bào các hạt nano Fe3O4 – Cs của đại thực bào tách được từ chuột cho thấy các đại thực bào có khả năng thu nhận
0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 0 1 2 3 4 5 6 7 Data 16 5:57:40 PM 11/6/2009 M(1 kOe) of B (emu/g) t (h) H = 1 kOe -0.04 -0.03 -0.02 -0.01 0 0.01 0.02 0.03 0.04 -2 104-1.5 104-1 104 -5000 0 5000 1 104 1.5 104 2 104 M(H) 305K B1, B2, B4, B6 da tru DC(-) Moment (emu/g) B1-DC(-) Moment (emu/g) B2-DC(-) Moment (emu/g) B4-DC(-) Moment (emu/g) B6-DC(-)
được rất nhiều hạt Fe3O4 – Cs vào bên trong tế bào. Bên cạnh đó các tế bào bạch cầu đơn nhân mà chúng tôi phân lập từ máu ngoại vi của người đã được chứng minh là biệt hóa thành đại thực bào gần 100% . Do đó chúng tôi tiến hành kiểm tra lại một lần nữa khả năng thu nhận các hạt nano của đại thực bào vừa được biệt hóa này.