2.2.1. Môi trường nuôi cấy
Môi trường nuôi cấy RPMI 1640 của Gibco BRL (Mỹ)
Môi trường nuôi cấy DMEM của Gibco BRL (Mỹ)
2.2.2. Hoá chất
FBS: Invitrogen, Mỹ
PBS: Invitrogen, Mỹ
Trypsine: của Gibco BRL (Mỹ)
Trypan Blue 0,4% của Merk
Nước cất và nước khử ion đã được khử trùng
hGM_CSF: (Granulocyte Macrophage colony stimulating fator, human, recombinant) Nhân tố kích thích tạo dòng đại thực bào của người (Mpbio, Mỹ)
Agarose: 2% trong PBS
Hoechst 33342 100ng, Invitrogen, Mỹ
BSA: Invitrogen, Mỹ
Paraformaldehyde
Texas Red®-XPhalloidin, Invitrogen, Mỹ
Anti - human CD14 antibodies, Invitrogen, Mỹ
Triton X - 100®
Fluoresence mounting medium, Dako, Mỹ
Ficoll Histopaque 1,077, Sigma
2.2.3. Máy móc thiết bị
Tủ hood của Esco, Mỹ
Tủ ấm CO2 của Shell Lab, Mỹ
Kính hiển vi soi ngược Axiovert 40CFL của Zeiss, Thụy Sỹ
Kính hiển vi quang học của Zeiss, Thụy Sỹ
Kính hiển vi laser quét Confocal LSM 510 của Zeiss, Thụy Sỹ
Pipette aid của Gilson
Pipette man 1ml, 200µl, 100µl, 10µl của Gilson
Máy li tâm Universal 320
Bình ổn nhiệt Gra Operation SS40-1, Đức
Máy lọc khí IQAir Cleanroom, Thụy sỹ
Nồi hấp ALP,Ltd, Nhật, Model CL-32L
Máy đo từ độ
Máy gia nhiệt
Máy ảnh
Máy votex WhirliMixer, Anh
Tủ lạnh Hitachi, Nhật
Bộ đồ mổ tiểu động vật
2.2.4. Vật tư tiêu hao
Chai nuôi T25, T75, đĩa pettri các cỡ, đĩa 24 và 96 giếng của Corning (Mỹ)
Ống ly tâm 15ml. 50ml, 1,5ml
Pipet - man các loại, màng lọc vô khuẩn loại 0,22µm của Satorius,
Coverslips, lam kính
Disposable cell Scraper 179693, Mỹ
Mao quản
Bơm tiêm 5ml
Dưới đây là một số hình ảnh minh họa về trang thiết bị, dụng cụ và hóa chất được sử dụng thường xuyên trong các thí nghiệm của đề tài này:
RPMI 1640 (Invitrogen) DMEM 11185 (Invitrogen) PBS 10x (Invitrogen)
Fetal Bovine Serum
(Invitrogen) Penicilin - Streptomicin
Ficoll
Mẫu Fe3O4 – Cs Mẫu Fe3O4 – Cs ~ Cur Mẫu Fe3O4 – Ole ~ Cur
Tủ sấy Kottermann, Đức Bình ổn nhiệt Gra
Operation SS40-1, Đức
Tủ ấm CO2 của Shell Lab (Mỹ)
Máy gia nhiệt
Pipetman và Pipet-aid (Gilson)
Đĩa nuôi cấy multiplates Đĩa nuôi cấy 100mm,
35mm
Lam kính Coverslip và lamenla Disposable cell Scraper
Hình 2.1: Hóa chất, trang thiết bị và đồ dùng tiêu hao
Kính hiển vi soi ngược
Axiovert 40CFL của Zeiss
(Thuỵ Sỹ)
Kính hiển vi laser quét
Confocal LSM 510 của
Zeiss (Thuỵ Sỹ)
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Gây tạo u báng cho động vật thí nghiệm và phương thức tác động của
dung dịch HHĐH
Phương pháp gây tạo u báng cho động vật thí nghiệm được tiến hành theo phương pháp thường quy của phòng Nghiên cứu Ung thư thực nghiệm:
Trích báng chuột (đã giữ giống 12 ngày) bằng kim tiêm loại 18G rồi đem pha loãng bằng dung dịch sinh lý PBS. Xác định mật độ tế bào bằng buồng đếm Thomas dưới kính hiển vi quang học. Sau đó đem pha huyền dịch tế bào sao cho có mật độ 5 x 106TB/ml. Tiêm 0,2ml huyền dịch vừa pha vào xoang bụng mỗi chuột tương đương 1 x 106TBUT/con. Sau khi cấy truyền ung thư chuột được phân lô, chăm sóc cẩn thận và theo dõi sự phát triển của u báng gây tạo (7).
Dung dịch Anolyte đã được điều chỉnh tạo thế oxy hóa khử khác nhau: +900mV với pH trung tính được thử nghiệm trên chuột theo phương thức tiêm vào xoang bụng chuột (i.p – intra peritoneal).
Dung dịch Katholyte được đưa vào chuột thử nghiệm theo phương thức cho chuột uống– xông thẳng thực quản (per.osophagus).
2.3.2. Xác định tỷ lệ chết của tế bào ung thư sau khi gia nhiệt ex vivo
Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng dòng TB Sarcoma 180. Quy trình tiến hành như sau:
Trích báng chuột đã được giữ giống 10 ngày bằng kim tiêm 18G.
Ly tâm tế bào 1200v/p trong 5 phút, rửa tế bào bằng PBS 3 lần.
Đếm tế bào, chia tế bào vào các ống ly tâm 1,5 ml với mật độ 1 triệu TB/ml.
Bổ sung hạt nano từ bọc Starch vào các ống tế bào
Gia nhiệt khảo sát ở hai điều kiện là khác nhau về nồng độ hạt nano từ và thời gian gia nhiệt các ống tế bào trên. Thí nghiệm gia nhiệt được thực hiện tại phòng Vật liệu Siêu dẫn, viện Khoa học Vật liệu.
Sau khi gia nhiệt, nhuộm TB bằng Blue trypan 0,4% theo tỷ lệ 1:1 trong 5 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó, tiến hành đếm và xác định tỷ lệ sống chết của tế bào.
2.3.3. Xác định tỷ số phát triển u (GR%) và tỷ số ức chế u (IR%), và thời gian
sống kéo dài thêm (ILS%)
Chúng tôi sử dụng 40 chuột Swiss đã được cấy truyền 106 tê bào Sarcoma 180 trong thí nghiệm này. Chuột được phân lô thí nghiệm như sau:
Bảng 2.1. Phân lô thí nghiệm nghiên cứu tác dụng của dung dịch HHĐH
Lô Mục đích ĐCUT (20 chuột) Anolyte +900mV (20 chuột)
Mổ sau 10 ngày cấy
truyền (chuột) 10 10
Theo dõi thời gian sống
của chuột (chuôt) 10 10
Ngày thứ 10 sau khi cấy truyền TBUT chúng tôi mổ một nửa số chuột ở mỗi lô để xác định số lượng tế bào ung thư có trong xoang bụng chuột nhằm xác định tỷ số phát triển u và tỷ số ức chế u của dung dịch HHĐH. Số chuột còn lại tiếp tục được chăm sóc theo dõi để xác định thời gian sống kéo dài thêm của chuột.
Phương pháp xác định GR% và IR% và ILS % của chuột thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp thường quy tại phòng thí nghiệm thuộc nhóm Nghiên cứu Ung thư thực nghiệm, Bộ môn Tế bào Mô Phôi và Lý sinh (8).
2.3.4. Phân lập đại thực bào
- Chuột Swiss 20 tuần tuổi (chuột già) được sử dụng cho thí nghiệm này do
đại thực bào tách ra từ chuột già đã trưởng thành, được biệt hóa hoàn toàn và có khả năng thực hiện chức năng thực bào tốt nhất.
- Dung dịch PBS có bổ sung 5% FBS được chuẩn bị để làm dung dịch tách đại thực bào. Sau khi mổ và tách da bụng chuột ra nhằm bộc lộ màng bao xoang bụng của chuột, dùng bơm tiêm 5ml hút dung dịch PBS có bổ sung 5 % FBS tiêm vào xoang bụng chuột thí nghiệm, lắc nhẹ chuột để dung dịch có thể lan đều xoang bụng. Hút dung dịch này ra khỏi xoang bụng, cho vào ống ly tâm 15ml, ly tâm 1000v/p, thu lấy tủa tế bào nuôi trong môi trường DMEM 1.1 Glucose có bổ sung thêm 5% FBS nuôi ổn định ở tủ ấm 37 o C, nồng độ CO2 là 5%.
b) Phân lập tế bào bạch cầu đơn nhân từ máu ngoại vi của người, kích thích chúng phát triển thành đại thực bào
Quy trình tách bạch cầu đơn nhân từ máu ngoại vi của người, sau đó kích thích các bạch cầu đơn nhân này phát triển thành đại thực bào được tiến hành như sau:
Chuẩn bị 5ml Ficoll (tỷ trọng 1,077mg/ml) cho vào ống Falcon 15ml
Pha loãng máu ngoại vi với tỷ lệ 1: 5 trong PBS 1x, sau đó để 30 phút ở nhiệt độ phòng. Ly tâm với tốc độ 1000g/20p ở nhiệt độ phòng.
Loại bỏ phẩn dịch nổi, thu phần tế bào phân cách giữa hai pha (màu trắng đục)
Pha loãng phần tế bào vừa thu được trong PBS tỷ lệ 1: 10
Hút 10ml phần dịch này nhỏ nhẹ nhàng vào ống Falcon 15 có chứa 5ml Ficoll đã chuẩn bị trước.
Ly tâm ở 800g trong 20 phút ở nhiệt độ phòng
Hút phần dịch trắng ở sát bề mặt Ficoll (~ 2ml) cho vào ống Falcon 50, bổ sung PBS 1x đến 20ml. Ly tâm ở 400g trong 25 phút ở nhiệt độ phòng.
Thu lấy tủa tế bào (phần tế bào này chứa phần lớn là bạch cầu đơn nhân), đánh tan phần tế bào này trong môi trường RPMI 10%FBS có bổ sung hGM_CSF tạo huyền phù tế bào. Chia huyền phù tế bào này vào các đĩa nuôi cấy, đặt trong tủ ấm (37oC, 5% CO2) (9) (2(10).
2.3.5. Xác định khả năng nhập bào của đại thực bào
a) Xác định hoạt tính của đại thực bào bằng kính hiển vi quang học
Do hạt nano từ bọc Chitosan không có khả năng phát màu khi được chiếu ánh sáng kích thích nên để xác định hoạt tính của đại thực bào chúng tôi phải tiến hành quan sát chuyển động của đại thực bào cũng như sự biến đổi màu sắc của đại thực bào sau khi được ủ với hạt nano từ.
Đối với đại thực bào của chuột, quy trình tiến hành như sau:
Nạp đại thực bào tách được từ chuột vào đĩa nuôi cấy
Bổ sung môi trường DMEM 5% FBS nuôi qua 24h để tế bào ổn định và bám đều trên mặt đĩa nuôi cấy
Ủ hạt nano từ vào đĩa chứa đại thực bào.
Quan sát ở các thời điểm: ngay sau khi ủ, sau khi ủ 30 phút, sau khi ủ 1h, sau khi ủ 2h.
Chụp ảnh và ghi lại chuyển động của đại thực bào
Đối với đại thực bào của người, do đại thực bào này được kích thích tạo nên từ bạch cầu đơn nhân, do đó cần có thời gian hoạt hóa lâu hơn. Sau khi tách bạch cầu đơn nhân và nuôi cấy trong môi trường có bổ sung chất kích thích hGM_CSF 20 ngày chúng tôi mới tiến hành khảo sát hoạt tính của chúng. Quy trình khảo sát cũng tương tự như đối với đại thực bào của chuột.
b) Xác định sự có mặt của hạt nano từ trong đại thực bào bằng tiêu bản hiển vi điện tử truyền qua
Để khẳng định chắc chắn hạt nano từ bọc Chitosan đã được đưa vào bên trong đại thực bào của chuột chúng tôi cũng tiến hành làm tiêu bản hiển vi điện tử truyền qua đối với đại thực bào chuột sau khi đã được ủ với hạt nano Fe3O4 – Cs.
Ly tâm tế bào, thu lấy tủa tế bào cố định ở Glutaraldehyde 2% trong đệm PBS 0.13 M (pH 7.3) trong 2h ở 4oC
Sau đó cố dịnh với osmium tetroxide 1% trong PBS 0.13 M (pH 7.3) trong 2h ở 4oC
Loại nước bằng dãy cồn ethanol
Ngâm trong nhựa thông Epon 812
Sử dụng máy cắt lát mỏng Ultracut-E (Reichert-Jung) để cắt mẫu thành các lát cắt rất mỏng
Nhuộm với uranyl acetate and lead citrate
Quan sát dưới kính hiển vi điện tử truyền qua (21)
c) Xác định hoạt tính của đại thực bào bằng kính hiển vi LSM 510
Do Curcumin có khả năng phát màu xanh khi có ánh sáng kích thích ở bước sóng ~488nm chiếu qua, do đó chúng tôi lợi dụng điều này để làm tiêu bản quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang LSM 510, nhằm chứng minh đại thực bào có khả năng đưa các hạt nano từ vào bên trong tế bào (hay khả năng nuốt các hạt nano từ). Để thực hiện được điều này chúng tôi làm tiêu bản miễn dịch huỳnh quang
Đại thực bào tách ra từ chuột được chuyển lên nuôi cấy ở các Coverslip (lam kính tròn) nuôi ổn định trong điều kiện nuôi cấy cho đại thực bào bám dính chặt trên bề mặt đĩa nuôi cấy.
Cố định tế bào trên lam kính bằng paraformaldehyde 4% trong vòng 10 phút.
Rửa loại bỏ paraformaldehyte bằng PBS 1x
Tạo tính thấm cho tế bào vừa cố định bằng Triton X-100 0,5% trong 15 phút.
Rửa tiêu bản bằng PBS 1x
Ủ 10 phút với BSA 2% pha trong PBS 1x.
Rửa bằng PBS
Ủ 90 phút với thuốc nhuộm đặc hiệu actin – Red Phalloidin có màu đỏ khi chiếu ánh sáng kích thích, sau đó rửa mẫu bằng PBS 1x.
Ủ tiếp 10 phút với thuốc nhuộm nhân tế bào Hoechst 33342
Rửa mẫu bằng PBS 1x sau đó lật ngược Coverslip gắn lên lam kính bằng Fluorescence Mounting Medium
Quan sát và chụp hình dưới kính hiển vi laser quét LSM 510
d) Đo từ độ định lượng từ tính của đại thực bào khi ủ với Fe3O4 – Ole ~ Cur
Đại thực bào tách từ chuột được ủ với hạt nano Fe3O4– Ole ~ Cur trong đĩa 24 giếng với hàm lượng 0.5mg/triệu tế bào.
Dừng ủ ở các thời điểm 1 giờ, 2 giờ, 4 giờ và 6 giờ. Rửa sạch tế bào bằng PBS.
Ly tâm thu lấy tế bào, đánh tan trong PBS sau đó cho vào các mao quản bẳng thủy tinh với mật độ 104 tế bào/10µl PBS
Đem đo từ độ tại phòng thí nghiệm Vật liệu Siêu dẫn, Viện Khoa học Vật liệu
2.3.6. Tạo mô hình khối cầu tế bào ung thư 3D (Spheroid) từ dòng tế bào MCF7 trong nuôi cấy in vitro. MCF7 trong nuôi cấy in vitro.
a) Hoạt hóa tế bào từ N2 lỏng
Sau khi lấy các tuýp chứa tế bào ung thư từ trong bình nitơ lỏng ra đưa ngay vào bể ổn nhiệt 37oC để rã đông.
Sau khi tế bào rã đông hoàn toàn, ly tâm 1000 vòng/5 phút để loại bỏ môi trường cất lạnh chứa DMSO.
Loại bỏ phần dịch nổi, giữ lại phần tế bào lắng đọng ở phía dưới ống ly tâm.
Bổ sung 1 ml môi trường vào ống ly tâm, dùng pipet đánh tan cặn tế bào, đưa toàn bộ huyền phù tế bào vào chai nuôi cấy 25 cm2 (Corning) đã có 4 ml môi trường.
Kiểm tra tế bào dưới kính hiển vi, và đưa chai nuôi cấy vào tủ ấm (37oC, 5% CO2) (16).
b) Tạo giọt treo tế bào, gây tạo khối Spheroid
Chuẩn bị Agarose 2% pha trong PBS 1x, khử trùng sau đó để ở nhiệt độ 90 oC trong tủ sấy (tránh để agarose bị đông trước khi làm thí nghiệm)
Chuẩn bị môi trường RPMI 10% FBS, 1% Penicilin – streptomycin, để ở nhiệt độ 65 oC
Trộn Agarose 2% với môi trường RPMI đã chuẩn bị với tỷ lệ 1:1
Nhanh tay nhỏ agarose vào đĩa 96 giếng: 50µl agarose/giếng
Để 2h để agarose đông hoàn toàn trên đĩa nuôi 96 giếng
Nhỏ 150µl môi trường RPMI 10% FBS, 1% Penicilin – streptomycin vào mỗi giếng của đĩa 96 đã phủ agarose
Tạo giọt treo tế bào trên nắp đĩa nuôi của đĩa đã phủ agarose ở trên với mật độ là 6000 tế bào/giọt/giếng
Đặt đĩa trong tủ ấm 37oC, 5% CO2 ổn định 24h. Hạ giọt treo tế bào xuống giếng đã bổ sung sẵn môi trường.
Theo dõi và chăm sóc các khối Spheroid vừa tạo được (20) (24)
Khối Spheroid nuôi cấy trong đĩa 96 giếng được thay môi trường 3 ngày 1 lần, loại bỏ 2/3 môi trường trong giếng sau đó bổ sung thêm môi trường mới vào giếng nuôi.
2.3.7. Xác định khả năng vận chuyển hạt nano từ của đại thực bào người vào trong khối Spheroid trong khối Spheroid
a) Kiểm tra hoạt tính của đại thực bào tách và hoạt hóa từ máu ngoại vi của người bằng cách ủ với hạt nano Fe3O4 – Cs ~ Cur. Làm tiêu bản miễn dịch huỳnh quang có ủ với anti-human CD14 antibodies.
Ủ đại thực bào của người với hạt nano từ bọc Chitosan gắn Curcumin (Fe3O4 – Cs ~ Cur), sau 8h ủ tiến hành làm tiêu bản miễn dịch huỳnh quang để quan sát.
Các bước làm tiêu bản miễn dịch huỳnh quang tương tự với phương pháp làm tiêu bản miễn dịch huỳnh quang trình bày ở mục 2.3.6 phần c ở trên. Thay vì nhuộm đặc hiệu actin bằng Red®-X Phalloidin, ở phần này chúng tôi nhuộm đặc hiệu CD14 của đại thực bào bằng anti-human CD14 antibodies.
b). Xác định sự có mặt của đại thực bào của người trong khối Spheroid nuôi cấy in vitro qua phương pháp nhuộm đặc hiệu với anti-human CD14 antibodies và quan sát dưới kính hiển vi LSM 510
Tế bào bạch cầu đơn nhân tách từ máu ngoại vi người và được biệt hóa thành ĐTB nhờ hGM_CSF được nuôi ổn định trong điều kiện nuôi cấy cho ĐTB bám dính chặt trên bề mặt đĩa nuôi cấy.
Ủ đại thực bào với hạt nano Fe3O4 – Cs, sau 48h ủ tách đại thực bào khỏi đĩa nuôi cấy và nhỏ chung với khối u thực nghiệm Spheroid đã gây tạo được với mật độ 105 ĐTB/Spheroid.
Sau khi ủ 10 ngày với khối Spheroid lấy Spheroid ra làm tiêu bản nhuộm đặc hiệu để chứng minh sự xâm nhập của ĐTB mang hạt nano từ bọc Chitosan vào trong lõi của khối Spheroid.
Cố định Spheroid bằng paraformaldehyde 10% trong vòng 15 phút, rửa loại bỏ paraformaldehyte bằng PBS 1x