thực nghiệm
Để kiểm tra khả năng đi vào lõi khối Spheroid của các đại thực bào người có mang hạt nano từ, chúng tôi ủ đại thực bào của người đã tách và nuôi được 20 ngày trong môi trường có hGM_CSF với hạt nano từ Fe3O4 – Cs với hàm lượng 0,5mg/triệu tế bào. Đại thực bào sau 48h ủ với hạt nano sẽ được ủ cùng với khối
Spheroid 17 ngày tuổi kể từ khi gây tạo. Mỗi Spheroid được ủ chung với 105 đại thực bào trong một giếng của đĩa 96. Như đã trình bày ở trên rằng đại thực bào tách từ người có khả năng thu nhận được ít hạt nano hơn so với đại thực bào tách từ xoang bụng của chuột, điều này có thể là do đại thực bào của người chưa được biệt hóa hoàn toàn trong môi trường nôi cấy. Do đó chúng tôi cũng ủ thêm vào mỗi giếng Spheroid có đại thực bào mang hạt nano ở trên 0.05mg hạt từ Fe3O4 – Cs để các đại thực bào trong quá trình di cư vào lõi khối Spheroid có thể sẽ thu nhận thêm các hạt nano vào bên trong. Các giếng chứa Spheroid, đại thực bào mang hạt nano từ và các hạt nano từ Fe3O4 – Cs này được nuôi ổn định trong trong trong điều kiện nuôi cấy ở tủ ấm 37°C, 5% CO2. Sau khoảng 1 ngày nuôi chung, chúng tôi quan sát thấy các đại thực bào bắt đầu tập trung vào xung quanh của khối Spheroid. Và những ngày sau đó các đại thực bào tập trung ngày càng gần và phủ lên cả phía trên bề mặt của các khối Spheroid này, chúng làm cho khối Spheroid trở nên sẫm màu hạt từ hơn so với nhóm Spheroid đối chứng khi quan sát dưới kính hiển vi quang học.
Đến ngày thứ 6 sau khi ủ chung các khối Spheroid này rửa bằng PBS để loại bỏ các đại thực bào không đi vào bên trong và các hạt nano từ dư thừa, sau đó được đem cố định và nhuộm đặc hiệu với Anti-human CD14 và quan sát dưới kính hiển vi LSM 510. Kết quả thu được đúng như mong đợi của chúng tôi, các đại thực bào đã đi vào phía trong của khối Spheroid.
A: Spheroid đối chứng, không ủ với đại
thực bào mang hạt nano từ
B: Spheroid ủ với đại thực bào người (mang
hạt Fe3O4 – Cs) màu vàng sẫm là màu của
hạt nano từ Fe3O4 – Cs
Hình 3.21 : Sự khác biệt về màu sắc của khối Spheroid ủ với đại thực bào mang hạt nano
từ và Spheroid đối chứng chụp dưới kính hiển vi quang học
A: Spheroid đối chứng, không ủ với đại
thực bào mang hạt nano từ
B: Spheroid ủ với đại thực bào người (mang
hạt Fe3O4 – Cs) màu vàng sẫm là màu của
hạt nano từ Fe3O4 – Cs
Hình 3.22: Sự khác biệt về màu sắc của khối Spheroid ủ với đại thực bào mang hạt nano
từ và Spheroid đối chứng chụp dưới ánh sáng truyền qua ở kính hiển vi LSM 510 Nhìn vào hình 3.21 và 3.22 ở trên ta có thể thấy sự khác biệt giữa nhóm Spheroid có và không ủ với đại thực bào mang hạt nano từ Fe3O4 – Cs. Ở nhóm có ủ với đại thực bào mang hạt nano từ (3.21B và 3.22B), khối Spheroid có các chấm màu vàng sẫm của hạt nano, rất giống với màu sắc của đại thực bào tách từ chuột khi đã ủ với Fe3O4 – Cs ở thí nghiệm trên.
Khi làm tiêu bản miễn dịch huỳnh quang nhuộm đặc hiệu với Anti-human CD14, hình ảnh thu được giúp chúng tôi khẳng định rằng đại thực bào đã đi vào lõi của khối u Spheroid nuôi cấy in vitro.
Hình 3.23: Đại thực bào (màu đỏ) đã tiến vào phía bên trong của khối Spheroid Hình ảnh được ghi lại khi chụp cắt lớp (15 lát cắt), mỗi lát cắt dày 4,7µm
Nhìn vào hình ảnh ta có thể thấy ở những lát cắt đầu tiên khi chưa đi sâu vào khối Spheroid, đại thực bào không hiện diện nhiều ở vùng này do màu đỏ rất nhạt. Khi đi vào các lát cắt sâu hơn 23,5µm đến 43,2µm màu đỏ đậm dần đặc biệt là ở trung tâm của khối Spheroid và thể hiện rất mạnh ở lát cắt 42,3µm đến 51,7µm. Ở các lát cắt sâu hơn mảu đỏ lại nhạt dần. Như vậy đại thực bào tách và biệt hóa từ máu ngoại vi của người có khả năng di cư vào phía bên trong của khối u thực nghiệm in vitro gây tạo từ dòng tế bào ung thư vứ MCF7 của người. Kết quả này cùng với các nghiên cứu khác trên thế giới đã mở ra rất nhiều hy vọng cho việc ứng dụng đại thực bào như một phương tiện chuyên chở các tác nhân đặc trị chống ung thư vào bên trong khối u, giúp tránh thương tổn tới các vùng mô lành xung quanh.
Mục tiêu ban đầu của đề tài là nghiên cứu tác dụng chống ung thư của hạt nano từ, nhưng khi tiến hành thực nghiệm đã nảy sinh vấn đề cần giải quyết là làm thế nào để đưa được các vật liệu nano từ vào trong khối u? Để giải quyết vấn đề này chúng tôi đã lựa chọn đại thực bào như một phương tiện chuyên chở các vật liệu từ, và đã khẳng định được rằng việc ứng dụng đại thực bào cho mục đích này là hoàn toàn có tính khả thi. Tuy nhiên do thời gian thực nghiệm có hạn nên chúng tôi chưa thể tiến hành xác định khả năng chuyên chở đại thực bào vào trong khối u in vivo, đồng thời tiến hành xác định khả năng giết chết tế bào ung thư khi gia nhiệt ex vivo
Spheroid và khối u rắn thực nghiệm. Đó sẽ là hướng cần nghiên cứu tiếp theo của để tài này.
KẾT LUẬN
1. Dung dịch HHĐH bao gồm dung dịch Anolyte có thế ôxi hóa khử +900mV, pH trung tính cùng với dung dịch Katholyte với thế ôxi hóa khử -800mV có khả năng ức chế sự hình thành u báng và kéo dài thời gian sống thêm của chuột nhắt trắng Swiss mang u báng Sarcoma 180. Tỷ số ức chế u đạt 92,85%, kéo dài thời gian sống thêm lên 99,6%.
2. Phương pháp gia nhiệt có khả năng giết chết tế bào ung thư Sarcoma 180. Thời gian gia nhiệt càng lâu, nồng độ hạt từ càng lớn thì tỷ lệ chết của tế bào ung thư càng nhiều. Tỷ lệ tế bào chết này tiếp tục tăng theo thời gian sau khi ngừng gia nhiệt.
3. Phân lập thành công đại thực bào từ xoang bụng chuột Swiss, đại thực bào tách được hoàn toàn có khả năng nhập các vật liệu nano từ vào trong tế bào, lượng vật liệu nano từ nhập vào tế bào tăng theo thời gian ủ cùng với tế bào.
4. Gây tạo thành công mô hình khối cầu ung thư thực nghiệm in vitro (Spheroid) từ dòng tế bào MCF7.
5. Phân lập và biệt hóa và nhân nuôi thành công đại thực bào từ tế bào bạch cầu đơn nhân thu nhận từ máu ngoại vi người khỏe mạnh. Đại thực bào này có khả năng nhập các vật liệu nano từ vào trong tế bào, đồng thời có khả năng vận chuyển chúng vào lõi khối Spheroid.
KIẾN NGHỊ
1. Tiếp tục nghiên cứu khả năng vận chuyển vật liệu nano từ của đại thực bào vào trong khối u thực nghiệm in vivo (mô hình u rắn trên chuột)
2. Tiếp tục khảo sát khả năng giết chết tế bào ung thư bằng phương pháp gia nhiệt sau khi
TÀI LIỆU THAM KHẢO
A. Tài liệu tiếng Việt
1. Bệnh viện Bạch Mai, (2003), Nghiên cứu tác dụng sát khuẩn của dung dịch
hoạt hóa điện hóa để chống nhiễm khuẩn ở bệnh viện
2. Nguyễn Hoàng Hải, Nguyễn Hữu Đức (2005), Chế tạo và ứng dụng hạt nano
từ tính trong Y sinh, Báo cáo hội nghị Vật lý toàn quốc lần VI.
3. Nguyễn Xuân Phúc, Thuyết minh đề tài độc lập cấp nhà nước, 2008 -2011
4. V. I. Prilutzskii (1997), Tổng quan và bình luận quan điểm của Nhật Bản về cơ chế tác động chống oxy hóa của dung dịch Katholyte, Báo cáo Hội thảo Quốc tế lần thứ nhất về Công nghệ Hoạt hóa điện hóa, Moskva, Russia
5. Nguyễn Thị Quỳ, (2009) “Nghiên cứu áp dụng công nghệ nuôi cấy tế bào 3D
in vitro tạo mô hình tuyển chọn các chất ức chế sự tăng sinh mạch máu và kháng u từ dược liệu Việt Nam”
6. Petra Šibilskis Nước hoạt hóa - Nước huyền bí (Wonderful Water), Panevežys, Lithuania.
7. Nguyễn Anh Tuấn, (2008), Luận văn Thạc sỹ vật lý.
8. Phí Thị Xuyến, Lê Xuân Hội (2007) “Hiệu chỉnh quy trình sản xuất và nghiên cứu tác dụng kháng u của nước kích hoạt điện hóa trên chuột nhắt
trắng dòng Swiss”. Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong Khoa học Sự sống,
213 – 216.
B. Tài liệu tiếng Anh
9. Human Macrophage Nucleofector Kit.1 - 4.
10. Berthold, F. 1981. Isolation of human monocytes by ficoll density gradient
11. Bij, G. J. v. d. 2005. The role of macrophages in tumor development.
Cellular Oncology 27:203 - 213.
12. Choi, M.-R. 2007. A Cellular Trojan Horse for Delivery of Therapeutic
Nanoparticles into Tumors NANO LETTERS 7:3759 - 3765
13. Desoize, B. 2000. Contribution of three-dimensional culture to cancer
research. OncologyHematology 36:59 - 60.
14. Douglass, T. G. 2008. Macrophage colony stimulating factor: Not just for
macrophages anymore! A gateway into complex biologies? elsevier 8:1354– 1376.
15. Falk M. H, I. R. D. 2001. Hyperthermia in oncology. 7:1-18. 16. Freshney, R. I. 2005. Culture of Animal cell.
17. Gerhard, H. 1998. Multicellular spheroids as an in vitro tumor model.
Cancer Letters 131:29-34.
18. Hamilton, G. 1998. Emerging use of nanoparticles in diagnosis and
treatment of breast cancer Cancer Letters 131:29 - 34.
19. Huanyu Dou, C. J. D. 2006. Development of a macrophage-based
nanoparticle platform for antiretroviral drug delivery. Blood 108:2827 -2835. 20. Julia Poland, P. S. A. S. M. S. 2002. Comparison of protein expression
profiles between monolayer and spheroid cell culture of HT-29 cells revealed fragmentation of CK18 Electrophoresis 23:1174–1184.
21. Kiyokazu Kametani, T. N. 2008. Elemental Analysis of Aluminum
Accumulations in the Livers, Kidneys and Brains of Mice Observed by HAADF-STEM-EDX. ANNALS OF MICROSCOPY 8:45 - 57.
22. Lee, J., G. D. Lilly, R. C. Doty, P. Podsiadlo, and N. A. Kotov. 2009. In
vitro Toxicity Testing of Nanoparticles in 3D Cell Culture. Small 5:1213-
1221.
23. Leek, R. D., and A. L. Harris. 2002. Tumor-Associated Macrophages in
Breast Cancer. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia 7:177-
24. Masters, J. R. W. 2000. animal cell culture.134.
25. PARK, K.-J. L. S.-K. 2009. Anticancer Effect of Alkaline Reduced Water.
26. Shih, J.-Y. 2006. Tumor-Associated Macrophage: Its Role in Cancer
Invasion and Metastasis Cancer Molecules 2:101 - 106.
27. Teicher, B. A. 1997. Anticancer drug development guide. Human Press.
28. Wu, Y. 2006. Preparation and characterization of chitosan–poly(acrylic acid)
polymer magnetic microspheres. Polymer 47:5287–5294.
29. Yahagi, N. 2000. Effect of electrolyzed water on wound healing. Artif
Organs 24:984 - 987.
30. Zhanga, L. 2009. Photochemical preparation of magnetic chitosan beads for
immobilization of pullulanase. Biochemical Engineering 46:83 - 87.
C. Tài liệu Internet
31. http://greenyourenvironment.com/2009/10/anti-cancer-effect-of-alkaline- reduced-water/
32. http://vi.wikipedia.org/wiki/chụp_cộng_hưởng_từ
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU... 1
1.1. DUNG DỊCH HHĐH VÀ ỨNG DỤNG TRONG Y SINH... 3
1.1.1. Đặc điểm của dung dịch hoạt hóa điện hóa... 3
1.1.2. Ứng dụng của dung dịch hoạt hóa điện hóa trong y sinh... 4
1.2. NHỮNG KHÁI NHIỆM CƠ BẢN VỀ HẠT NANO TỪ VÀ ỨNG DỤNG TRONG Y SINH ... 8
1.2.1. Một số khái niệm cơ bản... 8
1.2.2. Một số ứng dụng của hạt nano từ trong sinh y học... 11
1.3. ĐẶC ĐIỂM CỦA KHỐI U TRONG CƠ THỂ... 18
1.3.1. Đặc điểm về cấu trúc... 18
1.3.2. Đặc điểm về chức năng... 19
1.4. ĐẠI THỰC BÀO – PHƯƠNG TIỆN VẬN CHUYỂN VẬT LIỆU NANO TỪ VÀO TRONG KHỐI U... 20
1.4.1. Nguồn gốc của đại thực bào ... 20
1.4.2. Chức năng của đại thực bào ... 21
1.4.3. Sự hấp dẫn đại thực bào đi vào các khối u... 22
1.4.4. Ứng dụng của đại thực bào trong liệu pháp chống ung thư... 24
1.5. KHỐI CẦU ĐA BÀO UNG THƯ (Multicellular tumor Spheroid)– MỘT MÔ HÌNH UNG THƯ IN VITRO... 24
1.5.1. Khối cầu đa bào và lịch sử nghiên cứu... 24
1.5.2. Cấu trúc và khả năng ứng dụng của Spheroid... 26
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU... 28
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU... 28
2.1.1. Động vật thí nghiệm... 28
2.1.2. Máu ngoại vi người khỏe mạnh... 28
2.1.4. Dung dịch HHĐH... 28
2.1.5. Dung dịch hạt nano từ... 29
2.2. HÓA CHẤT VÀ DỤNG CỤ THÍ NGHIỆM... 29
2.2.1. Môi trường nuôi cấy... 29
2.2.2. Hoá chất... 29
2.2.3. Máy móc thiết bị... 30
2.2.4. Vật tư tiêu hao... 31
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU... 34
2.3.1. Gây tạo u báng cho động vật thí nghiệm và phương thức tác động của dung dịch HHĐH... 34
2.3.2. Xác định tỷ lệ chết của tế bào ung thư sau khi gia nhiệt ex vivo... 34
2.3.3. Xác định tỷ số phát triển u (GR%) và tỷ số ức chế u (IR%), và thời gian sống kéo dài thêm (ILS%) ... 35
2.3.4. Phân lập đại thực bào ... 35
2.3.5. Xác định khả năng nhập bào của đại thực bào ... 37
2.3.6. Tạo mô hình khối cầu tế bào ung thư 3D (Spheroid) từ dòng tế bào MCF7 trong nuôi cấy in vitro... 40
2.3.7. Xác định khả năng vận chuyển hạt nano từ của đại thực bào người vào trong khối Spheroid ... 41
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN... 43
3.1. TÁC DỤNG CHỐNG UNG THƯ CỦA DUNG DỊCH HHĐH... 43
3.2. TÁC DỤNG DIỆT TẾ BÀO UNG THƯ BẰNG PHƯƠNG PHÁP GIA NHIỆT HẠT NANO TỪ... 46
3.3. PHƯƠNG PHÁP ĐƯA VẬT LIỆU NANO TỪ VÀO KHỐI U THỰC NGHIỆM51 3.3.1. Phân lập và biệt hóa thành công đại thực bào ... 51
a) Phân lập thành công đại thực bào từ xoang bụng chuột... 51
b) Phân lập và biệt hóa thành công bạch cầu đơn nhân từ máu ngoại vi của người thành đại thực bào ... 52
a) Khả năng nhập các vật liệu nano từ của đại thực bào tách từ chuột... 54
b) Khả năng nhập các hạt nano từ của đại thực bào người... 63
3.3.3. Gây tạo thành công khối cầu ung thư (Spheroid) và khả năng xâm nhập của đại thực bào người vào khối Spheroid nuôi cấy in vitro... 65
a) Gây tạo khối cầu tế bào ung thư... 65
b) Khả năng vận chuyển vật liệu nano từ của đại thực bào vào khối Spheroid thực nghiệm... 66
KẾT LUẬN... 71
KIẾN NGHỊ... 71