- Chuột Swiss 20 tuần tuổi (chuột già) được sử dụng cho thí nghiệm này do
đại thực bào tách ra từ chuột già đã trưởng thành, được biệt hóa hoàn toàn và có khả năng thực hiện chức năng thực bào tốt nhất.
- Dung dịch PBS có bổ sung 5% FBS được chuẩn bị để làm dung dịch tách đại thực bào. Sau khi mổ và tách da bụng chuột ra nhằm bộc lộ màng bao xoang bụng của chuột, dùng bơm tiêm 5ml hút dung dịch PBS có bổ sung 5 % FBS tiêm vào xoang bụng chuột thí nghiệm, lắc nhẹ chuột để dung dịch có thể lan đều xoang bụng. Hút dung dịch này ra khỏi xoang bụng, cho vào ống ly tâm 15ml, ly tâm 1000v/p, thu lấy tủa tế bào nuôi trong môi trường DMEM 1.1 Glucose có bổ sung thêm 5% FBS nuôi ổn định ở tủ ấm 37 o C, nồng độ CO2 là 5%.
b) Phân lập tế bào bạch cầu đơn nhân từ máu ngoại vi của người, kích thích chúng phát triển thành đại thực bào
Quy trình tách bạch cầu đơn nhân từ máu ngoại vi của người, sau đó kích thích các bạch cầu đơn nhân này phát triển thành đại thực bào được tiến hành như sau:
Chuẩn bị 5ml Ficoll (tỷ trọng 1,077mg/ml) cho vào ống Falcon 15ml
Pha loãng máu ngoại vi với tỷ lệ 1: 5 trong PBS 1x, sau đó để 30 phút ở nhiệt độ phòng. Ly tâm với tốc độ 1000g/20p ở nhiệt độ phòng.
Loại bỏ phẩn dịch nổi, thu phần tế bào phân cách giữa hai pha (màu trắng đục)
Pha loãng phần tế bào vừa thu được trong PBS tỷ lệ 1: 10
Hút 10ml phần dịch này nhỏ nhẹ nhàng vào ống Falcon 15 có chứa 5ml Ficoll đã chuẩn bị trước.
Ly tâm ở 800g trong 20 phút ở nhiệt độ phòng
Hút phần dịch trắng ở sát bề mặt Ficoll (~ 2ml) cho vào ống Falcon 50, bổ sung PBS 1x đến 20ml. Ly tâm ở 400g trong 25 phút ở nhiệt độ phòng.
Thu lấy tủa tế bào (phần tế bào này chứa phần lớn là bạch cầu đơn nhân), đánh tan phần tế bào này trong môi trường RPMI 10%FBS có bổ sung hGM_CSF tạo huyền phù tế bào. Chia huyền phù tế bào này vào các đĩa nuôi cấy, đặt trong tủ ấm (37oC, 5% CO2) (9) (2(10).