trong khối Spheroid
a) Kiểm tra hoạt tính của đại thực bào tách và hoạt hóa từ máu ngoại vi của người bằng cách ủ với hạt nano Fe3O4 – Cs ~ Cur. Làm tiêu bản miễn dịch huỳnh quang có ủ với anti-human CD14 antibodies.
Ủ đại thực bào của người với hạt nano từ bọc Chitosan gắn Curcumin (Fe3O4 – Cs ~ Cur), sau 8h ủ tiến hành làm tiêu bản miễn dịch huỳnh quang để quan sát.
Các bước làm tiêu bản miễn dịch huỳnh quang tương tự với phương pháp làm tiêu bản miễn dịch huỳnh quang trình bày ở mục 2.3.6 phần c ở trên. Thay vì nhuộm đặc hiệu actin bằng Red®-X Phalloidin, ở phần này chúng tôi nhuộm đặc hiệu CD14 của đại thực bào bằng anti-human CD14 antibodies.
b). Xác định sự có mặt của đại thực bào của người trong khối Spheroid nuôi cấy in vitro qua phương pháp nhuộm đặc hiệu với anti-human CD14 antibodies và quan sát dưới kính hiển vi LSM 510
Tế bào bạch cầu đơn nhân tách từ máu ngoại vi người và được biệt hóa thành ĐTB nhờ hGM_CSF được nuôi ổn định trong điều kiện nuôi cấy cho ĐTB bám dính chặt trên bề mặt đĩa nuôi cấy.
Ủ đại thực bào với hạt nano Fe3O4 – Cs, sau 48h ủ tách đại thực bào khỏi đĩa nuôi cấy và nhỏ chung với khối u thực nghiệm Spheroid đã gây tạo được với mật độ 105 ĐTB/Spheroid.
Sau khi ủ 10 ngày với khối Spheroid lấy Spheroid ra làm tiêu bản nhuộm đặc hiệu để chứng minh sự xâm nhập của ĐTB mang hạt nano từ bọc Chitosan vào trong lõi của khối Spheroid.
Cố định Spheroid bằng paraformaldehyde 10% trong vòng 15 phút, rửa loại bỏ paraformaldehyte bằng PBS 1x
Tạo tính thấm cho tế bào vừa cố định bằng Triton X-100 1% trong 30 phút. Rửa lại bằng PBS 1x
Ủ 10 phút với BSA 2% pha trong PBS 1x. Rửa bằng PBS
Ủ 90 phút với thuốc nhuộm đặc hiệu ĐTB với anti-human PE CD14 (có màu đỏ khi chiếu ánh sáng kích thích), sau đó rửa mẫu bằng PBS 1x.
Ủ tiếp 10 phút với thuốc nhuộm nhân tế bào Hoechst 33342
Rửa mẫu bằng PBS 1x sau đó hút Spheroid cho vào lam lõm, gắn lam men phủ kín lam lõm bằng Glycerin.
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN