HẠT NANO TỪ
3.2.1. Mô hình gia nhiệt ex vivo
Chúng tôi gây tạo mô hình u rắn và u báng thực nghiệm nhằm thử khả năng gia nhiệt để giết chết tế bào ung thư khi tiêm hạt nano từ trực tiếp vào khối u. Nhưng trong quá trình thực nghiệm cho thấy việc tiêm trực tiếp hạt nano từ vào khối u gặp rất nhiều khó khăn:
- Với khối u báng: hạt nano từ có thể tiêm trực tiếp vào khối u nhưng không đưa được nhiều. Mặt khác khi mổ quan sát thì thấy hạt nano từ phân tán không đều trong xoang bụng chuột, chúng chỉ tập trung xung quanh vị trí tiêm do đó hiệu quả gia nhiệt không cao.
- Với khối u rắn: Hạt nano khi tiêm trực tiếp liền bị trào ra ngoài theo vị trí của mũi kim tiêm, không thể đưa được vào bên trong khối u.
Chính vì những khó khăn trên mà chúng tôi lựa chọn mô hình ex vivo để nghiên cứu khả năng để giết chết tế bào ung thư bằng cách gia nhiệt hỗn hợp tế bào ung thư và hạt nano từ: Gây u báng Sarcoma 180 cho chuột nhắt trắng Swiss 4 tuần tuổi, sau 10 ngày cấy truyền chúng tôi trích tế bào Sarcoma 180 ra khỏi xoang bụng chuột. Ly tâm và rửa sạch 3 lần bằng PBS 1x để thu lấy tủa tế bào. Pha loãng tế bào ra thành huyền dịch chứa 50 triệu tế bào/ml sau đó bổ sung hạt nano từ bọc Starch (Fe3O4 – St) vào các tuýp, gia nhiệt với lượng thời gian khác nhau, gia nhiệt với nồng độ hạt nano từ khác nhau đồng thời theo dõi tỷ lệ chết của tế bào ở các thời điểm khác nhau sau khi kết thúc gia nhiệt.
3.2.2. Khả năng giết chết tế bào ung thư khi gia nhiệt với thời gian khác nhau
Chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của thời gian gia nhiệt tới tỷ lệ chết của tế bào ung thư Sarcoma 180 khi chúng được gia nhiệt cùng với hạt Fe3O4 – St với nồng độ 3mg/50 triệu TB. Tuýp hỗn hợp tế bào – hạt từ này được đưa vào một từ trường biến đồi với cường độ 12kA/m và tần suất 184kHz. Cường độ từ trường,
tần suất, nồng độ sắt từ được chọn lựa để nhiệt độ khi gia nhiệt đạt 47 ± 1o C. Ở nhiệt độ này các tế bào ung thư có thể bị giết chết khi được giữ ở một thời gian nhất định. Kết quả cho thấy thời gian gia nhiệt càng lâu thì tỷ lệ tế bào chết càng lớn. Đặc biệt là sau khi ngừng gia nhiệt tế bào Sarcoma 180 vẫn tiếp tục chết thêm theo thời gian. Hình 3.2 A thể hiện tỷ lệ chết của tế bào Sarcoma 180 theo thời gian gia nhiệt, và hình 3.2 B minh họa sự tăng lượng tế bào chết theo thời gian sau khi đã ngừng gia nhiệt.
Hình 3.2 A. Tỷ lệ chết tế bào Sarcoma 180 chết khi thời gian gia nhiệt cùng với hạt nano
khác nhau ở cường độ 12kA/m, Tần số
184kHz.
Hình 3.2B. Tỷ lệ chết của tế bào Sarcoma phụ thuộc vào thời gian sau khi gia nhiệt kết
thúc
Hình 3.2. Tỷ lệ chết của tế bào Sarcoma 180 phụ thuộc vào thời gian gia nhiệt và thời gian
sau khi ngừng gia nhiệt
Nhìn vào hình ảnh chúng ta có thể thấy khi gia nhiệt với thời gian khác nhau, thời gian gia nhiệt càng dài thì tỷ lệ chết càng cao. Ở hình 3.2 A minh họa các mẫu được gia nhiệt với các mốc thời gian 20p, 30p, 45p, 60p, 75p, 100p. Thời gian gia nhiệt càng lớn thì tỷ lệ chết của tế bào ung thư càng nhiều, đến thời điểm gia nhiệt 100p thì hầu như toàn bộ tế bào ung thư đã bị giết chết. Mẫu gia nhiệt 30p tại thời điểm ngay sau khi gia nhiệt xong, lượng tế bào chết chỉ đạt 15% nhưng sau 60p khi ngừng gia nhiệt tức tại thời điểm 90p trên đồ thị hình 3.2 B tỷ lệ tế bào chết đã tăng
lên đến hơn 70% và đến thời điểm 500p sau khi gia nhiệt thì hầu như toàn bộ tế bào ung thư đã bị giết chết.
Bảng 3.2. Tỷ lệ tế bào Sarcoma 180 bị chếtở các thời gian gia nhiệt khác nhau với hạt Fe3O4 – St
Thời gian gia
nhiệt
Thời điểm
15p 30p 45p 60p 75p 100p ĐC 1 ĐC 2 ĐC 3
Ngay sau gia nhiệt (%)
5,40 9,80 39,74 59,20 86,26 96,47 1,20 1,34 2,59 Sau gia nhiệt 30p
(%)
15,00 45,23 49,00 69,30 94,07 100,00 1,30 1,31 2,80
ĐC 1: mẫu tế bào Sarcoma 180 không ủ hạt nano từ và không gia nhiệt ĐC 2: mẫu tế bào Sarcoma 180 có ủ hạt nano từ và không gia nhiệt ĐC 3: mẫu tế bào Sarcoma 180 không ủ hạt nano từ và gia nhiệt 100p
Để minh họa cho những kết quả gia nhiệt chúng tôi có chụp lại hình ảnh qua kính hiển vi quang học về tỷ lệ tế bào sống chết của các mẫu thí nghiệm.
Hình 3.3: Tế bào Sarcoma 180 đối chứng được giữ trong thời gian 72 giờ
Hình 3.4: Tế bào Sarcoma không ủ với hạt
nano từ 72 giờ sau khi gia nhiệt Hai mẫu đối chứng không ủ cùng với hạt nano từ Fe3O4 – St, một mẫu không gia nhiệt (hình 3.3) và một mẫu được gia nhiệt (hình 3.4) sau đó cùng để ổn định trong 72h rồi đếm tỷ lệ sống chết. Kết quả cho thấy cả hai mẫu có tỷ lệ tế bào chết tương đương nhau. Điều này khẳng định rằng các tế bào Sarcoma 180 có thể sống sót ít nhất 72h, đồng thời khẳng định rằng gia nhiệt bằng từ trường mẫu không chứa hạt từ không gây ảnh hưởng đến tỷ lệ chết của tế bào ung thư cũng như là các tế bào
sống khác. Nó khẳng định rằng có thể sử dụng được mô hình gia nhiệt invivo để giết chết các tế bào ung thư để điều trị cho cơ thể người.
Hình 3.5. Mẫu tế bào Sarcoma 180 ủ với hạt Fe3O4 – St và được gia nhiệt 75p
A: Ngay sau khi ngừng gia nhiệt
B: Sau khi ngừng gia nhiệt 45p
Sau khi gia nhiệt 75p thì lượng tế bào ung thư chết rất nhiều (hình 3.5 A). Đặc biệt là sau khi ngừng gia nhiệt được 45p, đếm lượng tế bào sống chết cho thấy tỷ lệ tế bào chết đã tăng lên rõ rệt (hình 3.5 B) chỉ còn vài tế bào sống sót. Như đã nói ở trên để toàn bộ số tế bào ung thư chết phải mất thời gian rất lâu, lên tới 500p sau khi ngừng gia nhiệt (hình 3.2B).
Như vậy với thời gian gia nhiệt càng lâu thì lượng tế bào ung thư chết càng lớn, sau khi ngừng gia nhiệt tế bào ung thư vẫn tiếp tục chết với số lượng tăng dần theo thời gian.
3.2.3. Tỷ lệ chết của tế bào ung thư khi gia nhiệt với các nồng độ hạt nano từ
khác nhau
Chúng tôi bố trí thí nghiệm gia với các nồng độ hạt nano từ Fe3O4 – St lần lượt là 1,5mg, 2,25mg, 3mg, 3,75mg cho 50tr tế bào Sarcoma 180 để nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ hạt nano từ đến tỷ lệ sống chết của tế bào sau khi gia nhiệt. Các mẫu được gia nhiệt với thời gian 30p, sau khi gia nhiệt mẫu tế bào được nhuộm
A B
với trypan-blue rồi xác định tỷ lệ tế bào chết. Kết quả thu tổng hợp được trình bày ở bảng 3.4.
Bảng 3.3. Tỷ lệ chết của tế bào Sarcoma 180 khi gia nhiệt với các nồng độ Fe3O4 – St Nồng độ hạt nano từ (mg)
Mẫu
1,50 2,25 3,00 3,75 ĐC 1 ĐC2
Tỷ lệ tế bào chết (%) 45,00 51.10 58,20 89,13 3,00 4,13
ĐC 1: Mẫu tế bào Sarcoma 180 không ủ hạt từ, không gia nhiệt
ĐC 2: Mẫu tế bào Sarcoma 180 ủ hạt từ (3,75mg/50trTB), không gia nhiệt
Tỷ lệ chết của tế bào khi gia nhiệt với các nồng độ hạt nano từ khác nhau 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 1 2 3 4 mg/50trTb %
Hình 3.6. Đồ thị thể hiện tỷ lệ chết của tế bào Sarcoma 180 khi ủ với các nồng độ
hạt nano từ khác nhau
Nhìn vào bẳng số liệu và biểu đồ ta có thể thấy rằng khi nồng độ hạt nano từ trong khối u exvivo càng lớn thì khi gia nhiệt tỷ lệ chết của tế bào càng cao. Khi nồng độ hạt nano từ là 3,75mg/50 triệu tế bào thì sau khi gia nhiệt 30 phút tỷ lệ chết của tế bào đạt tới 89,13%.
Phương pháp gia nhiệt hạt nano từ hoàn toàn có khả năng giết chết tế bào ung thư Sarcoma 180. Khi thời gian gia nhiệt càng lâu và nồng độ hạt nano từ càng cao thì tỷ lệ chết của tế bào sau khi gia nhiệt càng lớn. Mặt khác sau khi ngừng gia nhiệt, tế bào ung thư vẫn tiếp tục chết theo thời gian. Khi thời gian sau gia nhiệt đạt tời 500p thì hầu như toàn bộ tế bào ung thư đã bị giết chêt. Điều nảy khẳng định một lần nữa hiệu quả của phương pháp nhiệt trị (gia nhiệt) bằng sự biến đổi từ trường trong điều trị ung thư.