MCF7 trong nuôi cấy in vitro.
a) Hoạt hóa tế bào từ N2 lỏng
Sau khi lấy các tuýp chứa tế bào ung thư từ trong bình nitơ lỏng ra đưa ngay vào bể ổn nhiệt 37oC để rã đông.
Sau khi tế bào rã đông hoàn toàn, ly tâm 1000 vòng/5 phút để loại bỏ môi trường cất lạnh chứa DMSO.
Loại bỏ phần dịch nổi, giữ lại phần tế bào lắng đọng ở phía dưới ống ly tâm.
Bổ sung 1 ml môi trường vào ống ly tâm, dùng pipet đánh tan cặn tế bào, đưa toàn bộ huyền phù tế bào vào chai nuôi cấy 25 cm2 (Corning) đã có 4 ml môi trường.
Kiểm tra tế bào dưới kính hiển vi, và đưa chai nuôi cấy vào tủ ấm (37oC, 5% CO2) (16).
b) Tạo giọt treo tế bào, gây tạo khối Spheroid
Chuẩn bị Agarose 2% pha trong PBS 1x, khử trùng sau đó để ở nhiệt độ 90 oC trong tủ sấy (tránh để agarose bị đông trước khi làm thí nghiệm)
Chuẩn bị môi trường RPMI 10% FBS, 1% Penicilin – streptomycin, để ở nhiệt độ 65 oC
Trộn Agarose 2% với môi trường RPMI đã chuẩn bị với tỷ lệ 1:1
Nhanh tay nhỏ agarose vào đĩa 96 giếng: 50µl agarose/giếng
Để 2h để agarose đông hoàn toàn trên đĩa nuôi 96 giếng
Nhỏ 150µl môi trường RPMI 10% FBS, 1% Penicilin – streptomycin vào mỗi giếng của đĩa 96 đã phủ agarose
Tạo giọt treo tế bào trên nắp đĩa nuôi của đĩa đã phủ agarose ở trên với mật độ là 6000 tế bào/giọt/giếng
Đặt đĩa trong tủ ấm 37oC, 5% CO2 ổn định 24h. Hạ giọt treo tế bào xuống giếng đã bổ sung sẵn môi trường.
Theo dõi và chăm sóc các khối Spheroid vừa tạo được (20) (24)
Khối Spheroid nuôi cấy trong đĩa 96 giếng được thay môi trường 3 ngày 1 lần, loại bỏ 2/3 môi trường trong giếng sau đó bổ sung thêm môi trường mới vào giếng nuôi.