Máu ngoại vi người khỏe mạnh

Máu ngoại vi của người khỏe mạnh, không nhiễm các bệnh truyền nhiễm, được cung cấp bởi viện Huyết học Truyền máu Trung ương. Chúng tôi sử dụng trong thí nghiệm này để tách bạch cầu đơn nhân, sau đó kích thích tạo dòng thành đại thực bào.

2.1.3. Tế bào ung thư MCF7 nuôi cấy in vitro

Tế bào ung thư MCF7 là dòng tế bào ung thư biểu mô vú của người, thời gian nhân đôi của các tế bào này là 29h, được cung cấp bởi Nhóm nghiên cứu Ung thư thực nghiệm thuộc bộ môn Tế bào –Mô- Phôi và Lý sinh thuộc Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội. Tế bào được sử dụng để tạo mô hình khối u thực nghiệm in vitro (Spheroid).

2.1.4. Dung dịch HHĐH

Dung dịch HHĐH do Trung tâm phát triển Công nghệ cao thuộc Viện khoa học Môi trường -Viện khoa học và Công nghệ Việt Nam cung cấp ở hai dạng:

- Anolyte với thế oxi hóa khử +900mV, pH trung bình từ 7,1 – 7,4 - Dung dịch Katholyte với thế oxy hóa khử – 800mV; pH = 11  13

2.1.5. Dung dịch hạt nano từ

Chúng tôi sử dụng bốn loại dung dịch hạt nano từ đó là hạt nano từ bọc Starch (Fe3O4 – St), hạt nano từ bọc Chitosan (Fe3O4 – Cs), hạt nano từ bọc Chitosan có gắn Curcumin (Fe3O4– Cs ~ Cur) và hạt nano từ bọc axit Oleic có gắn Curcumin (Fe3O4 – Ol~ Cur). Cả bốn loại hạt nano từ này đều được cung cấp bởi Viện Khoa học Vật liệu, thuộc Viện Khoa học Việt Nam:

Fe3O4 – St: dạng dung dịch, có hàm lượng sắt từ 10 mg/ml Fe3O4 – Cs: dạng dung dịch, có hàm lượng sắt từ 10 mg/ml Fe3O4 – Cs ~ Cur: dạng dung dịch, có hàm lượng sắt từ 8 mg/ml

Fe3O4 – Ol~ Cur: dạng dung dịch, có hàm lượng sắt từ 8 mg/ml

2.2. HÓA CHẤT VÀ DỤNG CỤ THÍ NGHIỆM2.2.1. Môi trường nuôi cấy 2.2.1. Môi trường nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy RPMI 1640 của Gibco BRL (Mỹ)

Môi trường nuôi cấy DMEM của Gibco BRL (Mỹ)

2.2.2. Hoá chất

FBS: Invitrogen, Mỹ

PBS: Invitrogen, Mỹ

Trypsine: của Gibco BRL (Mỹ)

Trypan Blue 0,4% của Merk

Nước cất và nước khử ion đã được khử trùng

hGM_CSF: (Granulocyte Macrophage colony stimulating fator, human, recombinant) Nhân tố kích thích tạo dòng đại thực bào của người (Mpbio, Mỹ)

Agarose: 2% trong PBS

Hoechst 33342 100ng, Invitrogen, Mỹ

BSA: Invitrogen, Mỹ

Paraformaldehyde

Texas Red®-XPhalloidin, Invitrogen, Mỹ

Anti - human CD14 antibodies, Invitrogen, Mỹ

Triton X - 100®

Fluoresence mounting medium, Dako, Mỹ

Ficoll Histopaque 1,077, Sigma

2.2.3. Máy móc thiết bị

Tủ hood của Esco, Mỹ

Tủ ấm CO2 của Shell Lab, Mỹ

Kính hiển vi soi ngược Axiovert 40CFL của Zeiss, Thụy Sỹ

Kính hiển vi quang học của Zeiss, Thụy Sỹ

Kính hiển vi laser quét Confocal LSM 510 của Zeiss, Thụy Sỹ

Pipette aid của Gilson

Pipette man 1ml, 200µl, 100µl, 10µl của Gilson

Máy li tâm Universal 320

Bình ổn nhiệt Gra Operation SS40-1, Đức

Máy lọc khí IQAir Cleanroom, Thụy sỹ

Nồi hấp ALP,Ltd, Nhật, Model CL-32L

Máy đo từ độ

Máy gia nhiệt

Máy ảnh

Máy votex WhirliMixer, Anh

Tủ lạnh Hitachi, Nhật

Bộ đồ mổ tiểu động vật

2.2.4. Vật tư tiêu hao

Chai nuôi T25, T75, đĩa pettri các cỡ, đĩa 24 và 96 giếng của Corning (Mỹ)

Ống ly tâm 15ml. 50ml, 1,5ml

Pipet - man các loại, màng lọc vô khuẩn loại 0,22µm của Satorius,

Coverslips, lam kính

Disposable cell Scraper 179693, Mỹ

Mao quản

Bơm tiêm 5ml

Dưới đây là một số hình ảnh minh họa về trang thiết bị, dụng cụ và hóa chất được sử dụng thường xuyên trong các thí nghiệm của đề tài này:

RPMI 1640 (Invitrogen) DMEM 11185 (Invitrogen) PBS 10x (Invitrogen)

Fetal Bovine Serum

(Invitrogen) Penicilin - Streptomicin

Ficoll

Mẫu Fe3O4 – Cs Mẫu Fe3O4 – Cs ~ Cur Mẫu Fe3O4 – Ole ~ Cur

Tủ sấy Kottermann, Đức Bình ổn nhiệt Gra

Operation SS40-1, Đức

Tủ ấm CO2 của Shell Lab (Mỹ)

Máy gia nhiệt

Pipetman và Pipet-aid (Gilson)

Đĩa nuôi cấy multiplates Đĩa nuôi cấy 100mm,

35mm

Lam kính Coverslip và lamenla Disposable cell Scraper

Hình 2.1: Hóa chất, trang thiết bị và đồ dùng tiêu hao

Kính hiển vi soi ngược

Axiovert 40CFL của Zeiss

(Thuỵ Sỹ)

Kính hiển vi laser quét

Confocal LSM 510 của

Zeiss (Thuỵ Sỹ)

2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1. Gây tạo u báng cho động vật thí nghiệm và phương thức tác động của

dung dịch HHĐH

Phương pháp gây tạo u báng cho động vật thí nghiệm được tiến hành theo phương pháp thường quy của phòng Nghiên cứu Ung thư thực nghiệm:

Trích báng chuột (đã giữ giống 12 ngày) bằng kim tiêm loại 18G rồi đem pha loãng bằng dung dịch sinh lý PBS. Xác định mật độ tế bào bằng buồng đếm Thomas dưới kính hiển vi quang học. Sau đó đem pha huyền dịch tế bào sao cho có mật độ 5 x 106TB/ml. Tiêm 0,2ml huyền dịch vừa pha vào xoang bụng mỗi chuột tương đương 1 x 106TBUT/con. Sau khi cấy truyền ung thư chuột được phân lô, chăm sóc cẩn thận và theo dõi sự phát triển của u báng gây tạo (7).

Dung dịch Anolyte đã được điều chỉnh tạo thế oxy hóa khử khác nhau: +900mV với pH trung tính được thử nghiệm trên chuột theo phương thức tiêm vào xoang bụng chuột (i.p – intra peritoneal).

Dung dịch Katholyte được đưa vào chuột thử nghiệm theo phương thức cho chuột uống– xông thẳng thực quản (per.osophagus).

2.3.2. Xác định tỷ lệ chết của tế bào ung thư sau khi gia nhiệt ex vivo

Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng dòng TB Sarcoma 180. Quy trình tiến hành như sau:

 Trích báng chuột đã được giữ giống 10 ngày bằng kim tiêm 18G.

 Ly tâm tế bào 1200v/p trong 5 phút, rửa tế bào bằng PBS 3 lần.

 Đếm tế bào, chia tế bào vào các ống ly tâm 1,5 ml với mật độ 1 triệu TB/ml.

 Bổ sung hạt nano từ bọc Starch vào các ống tế bào

 Gia nhiệt khảo sát ở hai điều kiện là khác nhau về nồng độ hạt nano từ và thời gian gia nhiệt các ống tế bào trên. Thí nghiệm gia nhiệt được thực hiện tại phòng Vật liệu Siêu dẫn, viện Khoa học Vật liệu.

 Sau khi gia nhiệt, nhuộm TB bằng Blue trypan 0,4% theo tỷ lệ 1:1 trong 5 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó, tiến hành đếm và xác định tỷ lệ sống chết của tế bào.

2.3.3. Xác định tỷ số phát triển u (GR%) và tỷ số ức chế u (IR%), và thời gian

sống kéo dài thêm (ILS%)

Chúng tôi sử dụng 40 chuột Swiss đã được cấy truyền 106 tê bào Sarcoma 180 trong thí nghiệm này. Chuột được phân lô thí nghiệm như sau:

Bảng 2.1. Phân lô thí nghiệm nghiên cứu tác dụng của dung dịch HHĐH

Lô Mục đích ĐCUT (20 chuột) Anolyte +900mV (20 chuột)

Mổ sau 10 ngày cấy

truyền (chuột) 10 10

Theo dõi thời gian sống

của chuột (chuôt) 10 10

Ngày thứ 10 sau khi cấy truyền TBUT chúng tôi mổ một nửa số chuột ở mỗi lô để xác định số lượng tế bào ung thư có trong xoang bụng chuột nhằm xác định tỷ số phát triển u và tỷ số ức chế u của dung dịch HHĐH. Số chuột còn lại tiếp tục được chăm sóc theo dõi để xác định thời gian sống kéo dài thêm của chuột.

Phương pháp xác định GR% và IR% và ILS % của chuột thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp thường quy tại phòng thí nghiệm thuộc nhóm Nghiên cứu Ung thư thực nghiệm, Bộ môn Tế bào Mô Phôi và Lý sinh (8).

2.3.4. Phân lập đại thực bào

- Chuột Swiss 20 tuần tuổi (chuột già) được sử dụng cho thí nghiệm này do

đại thực bào tách ra từ chuột già đã trưởng thành, được biệt hóa hoàn toàn và có khả năng thực hiện chức năng thực bào tốt nhất.

- Dung dịch PBS có bổ sung 5% FBS được chuẩn bị để làm dung dịch tách đại thực bào. Sau khi mổ và tách da bụng chuột ra nhằm bộc lộ màng bao xoang bụng của chuột, dùng bơm tiêm 5ml hút dung dịch PBS có bổ sung 5 % FBS tiêm vào xoang bụng chuột thí nghiệm, lắc nhẹ chuột để dung dịch có thể lan đều xoang bụng. Hút dung dịch này ra khỏi xoang bụng, cho vào ống ly tâm 15ml, ly tâm 1000v/p, thu lấy tủa tế bào nuôi trong môi trường DMEM 1.1 Glucose có bổ sung thêm 5% FBS nuôi ổn định ở tủ ấm 37 o C, nồng độ CO2 là 5%.

b) Phân lập tế bào bạch cầu đơn nhân từ máu ngoại vi của người, kích thích chúng phát triển thành đại thực bào

Quy trình tách bạch cầu đơn nhân từ máu ngoại vi của người, sau đó kích thích các bạch cầu đơn nhân này phát triển thành đại thực bào được tiến hành như sau:

 Chuẩn bị 5ml Ficoll (tỷ trọng 1,077mg/ml) cho vào ống Falcon 15ml

 Pha loãng máu ngoại vi với tỷ lệ 1: 5 trong PBS 1x, sau đó để 30 phút ở nhiệt độ phòng. Ly tâm với tốc độ 1000g/20p ở nhiệt độ phòng.

 Loại bỏ phẩn dịch nổi, thu phần tế bào phân cách giữa hai pha (màu trắng đục)

 Pha loãng phần tế bào vừa thu được trong PBS tỷ lệ 1: 10

 Hút 10ml phần dịch này nhỏ nhẹ nhàng vào ống Falcon 15 có chứa 5ml Ficoll đã chuẩn bị trước.

 Ly tâm ở 800g trong 20 phút ở nhiệt độ phòng

 Hút phần dịch trắng ở sát bề mặt Ficoll (~ 2ml) cho vào ống Falcon 50, bổ sung PBS 1x đến 20ml. Ly tâm ở 400g trong 25 phút ở nhiệt độ phòng.

 Thu lấy tủa tế bào (phần tế bào này chứa phần lớn là bạch cầu đơn nhân), đánh tan phần tế bào này trong môi trường RPMI 10%FBS có bổ sung hGM_CSF tạo huyền phù tế bào. Chia huyền phù tế bào này vào các đĩa nuôi cấy, đặt trong tủ ấm (37oC, 5% CO2) (9) (2(10).

2.3.5. Xác định khả năng nhập bào của đại thực bào

a) Xác định hoạt tính của đại thực bào bằng kính hiển vi quang học

Do hạt nano từ bọc Chitosan không có khả năng phát màu khi được chiếu ánh sáng kích thích nên để xác định hoạt tính của đại thực bào chúng tôi phải tiến hành quan sát chuyển động của đại thực bào cũng như sự biến đổi màu sắc của đại thực bào sau khi được ủ với hạt nano từ.

Đối với đại thực bào của chuột, quy trình tiến hành như sau:

 Nạp đại thực bào tách được từ chuột vào đĩa nuôi cấy

 Bổ sung môi trường DMEM 5% FBS nuôi qua 24h để tế bào ổn định và bám đều trên mặt đĩa nuôi cấy

 Ủ hạt nano từ vào đĩa chứa đại thực bào.

 Quan sát ở các thời điểm: ngay sau khi ủ, sau khi ủ 30 phút, sau khi ủ 1h, sau khi ủ 2h.

 Chụp ảnh và ghi lại chuyển động của đại thực bào

Đối với đại thực bào của người, do đại thực bào này được kích thích tạo nên từ bạch cầu đơn nhân, do đó cần có thời gian hoạt hóa lâu hơn. Sau khi tách bạch cầu đơn nhân và nuôi cấy trong môi trường có bổ sung chất kích thích hGM_CSF 20 ngày chúng tôi mới tiến hành khảo sát hoạt tính của chúng. Quy trình khảo sát cũng tương tự như đối với đại thực bào của chuột.

b) Xác định sự có mặt của hạt nano từ trong đại thực bào bằng tiêu bản hiển vi điện tử truyền qua

Để khẳng định chắc chắn hạt nano từ bọc Chitosan đã được đưa vào bên trong đại thực bào của chuột chúng tôi cũng tiến hành làm tiêu bản hiển vi điện tử truyền qua đối với đại thực bào chuột sau khi đã được ủ với hạt nano Fe3O4 – Cs.

 Ly tâm tế bào, thu lấy tủa tế bào cố định ở Glutaraldehyde 2% trong đệm PBS 0.13 M (pH 7.3) trong 2h ở 4oC

 Sau đó cố dịnh với osmium tetroxide 1% trong PBS 0.13 M (pH 7.3) trong 2h ở 4oC

 Loại nước bằng dãy cồn ethanol

 Ngâm trong nhựa thông Epon 812

 Sử dụng máy cắt lát mỏng Ultracut-E (Reichert-Jung) để cắt mẫu thành các lát cắt rất mỏng

 Nhuộm với uranyl acetate and lead citrate

 Quan sát dưới kính hiển vi điện tử truyền qua (21)

c) Xác định hoạt tính của đại thực bào bằng kính hiển vi LSM 510

Do Curcumin có khả năng phát màu xanh khi có ánh sáng kích thích ở bước sóng ~488nm chiếu qua, do đó chúng tôi lợi dụng điều này để làm tiêu bản quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang LSM 510, nhằm chứng minh đại thực bào có khả năng đưa các hạt nano từ vào bên trong tế bào (hay khả năng nuốt các hạt nano từ). Để thực hiện được điều này chúng tôi làm tiêu bản miễn dịch huỳnh quang

Đại thực bào tách ra từ chuột được chuyển lên nuôi cấy ở các Coverslip (lam kính tròn) nuôi ổn định trong điều kiện nuôi cấy cho đại thực bào bám dính chặt trên bề mặt đĩa nuôi cấy.

 Cố định tế bào trên lam kính bằng paraformaldehyde 4% trong vòng 10 phút.

 Rửa loại bỏ paraformaldehyte bằng PBS 1x

 Tạo tính thấm cho tế bào vừa cố định bằng Triton X-100 0,5% trong 15 phút.

 Rửa tiêu bản bằng PBS 1x

 Ủ 10 phút với BSA 2% pha trong PBS 1x.

 Rửa bằng PBS

 Ủ 90 phút với thuốc nhuộm đặc hiệu actin – Red Phalloidin có màu đỏ khi chiếu ánh sáng kích thích, sau đó rửa mẫu bằng PBS 1x.

 Ủ tiếp 10 phút với thuốc nhuộm nhân tế bào Hoechst 33342

 Rửa mẫu bằng PBS 1x sau đó lật ngược Coverslip gắn lên lam kính bằng Fluorescence Mounting Medium

 Quan sát và chụp hình dưới kính hiển vi laser quét LSM 510

d) Đo từ độ định lượng từ tính của đại thực bào khi ủ với Fe3O4 – Ole ~ Cur

 Đại thực bào tách từ chuột được ủ với hạt nano Fe3O4– Ole ~ Cur trong đĩa 24 giếng với hàm lượng 0.5mg/triệu tế bào.

 Dừng ủ ở các thời điểm 1 giờ, 2 giờ, 4 giờ và 6 giờ. Rửa sạch tế bào bằng PBS.

 Ly tâm thu lấy tế bào, đánh tan trong PBS sau đó cho vào các mao quản bẳng thủy tinh với mật độ 104 tế bào/10µl PBS

 Đem đo từ độ tại phòng thí nghiệm Vật liệu Siêu dẫn, Viện Khoa học Vật liệu

2.3.6. Tạo mô hình khối cầu tế bào ung thư 3D (Spheroid) từ dòng tế bào MCF7 trong nuôi cấy in vitro. MCF7 trong nuôi cấy in vitro.

a) Hoạt hóa tế bào từ N2 lỏng

 Sau khi lấy các tuýp chứa tế bào ung thư từ trong bình nitơ lỏng ra đưa ngay vào bể ổn nhiệt 37oC để rã đông.

 Sau khi tế bào rã đông hoàn toàn, ly tâm 1000 vòng/5 phút để loại bỏ môi trường cất lạnh chứa DMSO.

 Loại bỏ phần dịch nổi, giữ lại phần tế bào lắng đọng ở phía dưới ống ly tâm.

 Bổ sung 1 ml môi trường vào ống ly tâm, dùng pipet đánh tan cặn tế bào, đưa toàn bộ huyền phù tế bào vào chai nuôi cấy 25 cm2 (Corning) đã có 4 ml môi trường.

 Kiểm tra tế bào dưới kính hiển vi, và đưa chai nuôi cấy vào tủ ấm (37oC, 5% CO2) (16).

b) Tạo giọt treo tế bào, gây tạo khối Spheroid

 Chuẩn bị Agarose 2% pha trong PBS 1x, khử trùng sau đó để ở nhiệt độ 90 oC trong tủ sấy (tránh để agarose bị đông trước khi làm thí nghiệm)

 Chuẩn bị môi trường RPMI 10% FBS, 1% Penicilin – streptomycin, để ở nhiệt độ 65 oC

 Trộn Agarose 2% với môi trường RPMI đã chuẩn bị với tỷ lệ 1:1

 Nhanh tay nhỏ agarose vào đĩa 96 giếng: 50µl agarose/giếng

 Để 2h để agarose đông hoàn toàn trên đĩa nuôi 96 giếng

 Nhỏ 150µl môi trường RPMI 10% FBS, 1% Penicilin – streptomycin vào mỗi giếng của đĩa 96 đã phủ agarose

 Tạo giọt treo tế bào trên nắp đĩa nuôi của đĩa đã phủ agarose ở trên với mật độ là 6000 tế bào/giọt/giếng

 Đặt đĩa trong tủ ấm 37oC, 5% CO2 ổn định 24h. Hạ giọt treo tế bào xuống giếng đã bổ sung sẵn môi trường.

 Theo dõi và chăm sóc các khối Spheroid vừa tạo được (20) (24)

Khối Spheroid nuôi cấy trong đĩa 96 giếng được thay môi trường 3 ngày 1