Khảnăng phânhủy 2,4-D, 2,4,5-T bởi các chủng đơn và hỗn hợp vi khuẩn đã
2.2.1. Phân lập, nuôi cấy vi sinh vật
2.2.1.1. Phân lập chủng nấm
Nấm tươi được thu thập từ rừng Quốc gia Ba Vì, chuyển về phịng thí nghiệm chụp ảnh. Trước khi phân lập hoạt tính enzyme thuộc oxidoreductase và peroxidase đã được đánh giá sơ bộ bằng cách: cân 1 g nấm tươi, nghiền nhỏ và bổ sung 10 ml nước cất 1 lần, lắc trong vịng 30 phút, sau đó tiến hành đo hoạt tính laccase, MnP, LiP hỗn hợp in-situ. Tiến hành phân lập, làm sạch trên môi trường PDA bổ sung guaniacol 1 % để nhận biết song song khả năng sinh tổng hợp oxidoreductase và peroxidase (laccase, LiP và MnP) thơng qua vịng có màu nâu đỏ là sản phẩm oxy hóa guaniacol.
2.2.1.2. Phân lập xạ khuẩn
Xạ khuẩn được phân lập theo phương pháp cấy chuyển nhiều lần trên môi trường Gause M thạch chứa DCĐ (là dịch chiết từ đất ô nhiễm nặng chất diệt cỏ/dioxin tại sân bay Biên Hoà và Đà Nẵng có chứa các chất 2,4,5-T; 2,4-D; TCP; DCP và các đồng loại độc của dioxin trong đó có đồng loại 2,3,7,8-TCDD có tổng độ độc ban đầu từ 10.000 đến 20.000 ng-TEQ/kg).
2.2.1.3. Lựa chọn môi trường nuôi cấy để chủng nấm sinh tổng hợp laccase cao
Chủng nấm lựa chọn được ni trong bình trụ 250 ml với 100 ml mơi trường TSH1; PDB; PDB có bổ sung 1 % bột đậu tương; Czapeck; dịch chiết khoai tây; MEG và Vis ở điều kiện nhiệt độ 30°C và lắc ở tốc độ 120 vòng/phút. Hàng ngày tiến hành hút dịch để đo hoạt tính laccase đến thời điểm hoạt tính đạt giá trị cao nhất và bắt đầu giảm thì dừng đo để thu dịch. Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
2.2.1.4. Ni cấy xạ khuẩn sinh tổng hợp laccase-like trên các nguồn chất hữu cơ vòng thơm khác nhau
Các chủng xạ khuẩn được ni lắc trong bình tam giác 250 ml với 100 ml môi trường nuôi cấy Gause M (thành phần giống Gause M thạch nhưng khơng có thạch) chứa riêng biệt các chất DCĐ (4 đến 16% theo thể tích dung dịch ni cấy); 2,4-D; 2,4,5-T; DBF hoặc PAHs (hỗn hợp của anthracen và pyrence với tỷ lệ 1:1 theo thể tích) (tinh khiết của Sigma) có nồng độ từ 100 đến 400 ppm. Giống xạ khuẩn được bổ sung 10% theo thể tích ở nhiệt độ 30°C, lắc trên máy lắc với tốc độ 150 vịng/phút. Hoạt tính laccase-like được xác định giống như phương pháp chuẩn xác định như với laccase thật theo thời gian.