Hình thái khuẩn lạc và hình thái bào tử củ a2 chủng nghiên cứu cho thấy chúng
3.2.2. Tinh sạch laccase-like từ xạ khuẩn Streptomycese sp XKBiR
Laccase-like là một hoạt chất sinh học đã được mô tả ở một số nghiên cứu trước đây ở Việt Nam, đây là một hoạt chất có đặc tính khá đặc biệt nên chưa có quy trình chuẩn hoặc được mơ tả chi tiết để tinh sạch. Chính vì vậy, trong nghiên cứu này để có được những kết quả nghiên cứu, quy trình tinh sạch như đối với laccase thật đã được thực hiện. Tuy nhiên, có một số cơng đoạn được thay đổi để phù hợp với đặc tính của chất có nguồn gốc từ vi sinh vật trong đất ô nhiễm liên quan đến chất diệt cỏ/dioxin. Quá trình tinh sạch, dịch laccase-like thô được đưa qua cột sắc ký lọc gel, kết quả hoạt tính tăng lên 1,26 lần từ 3192 U/L đến 4.028 U/L, nồng độ protein giảm đi từ 0,0357 mg/ml xuống cịn 0,0116 mg/ml.
Hoạt tính laccase-like và hàm lượng “protein” của mỗi phân đoạn khi qua cột sắc ký lọc gel đều được xác định và được trình bày ở Hình 3.9. Phân đoạn có hoạt tính cao nhất sau q trình sắc ký lọc gel sẽ được đưa qua cột sắc ký trao đổi ion Hitrap QHP, “protein” được rửa giải ở nồng độ muối NaCl 0,1 M với hiệu suất 69,7% và nồng độ “protein” đạt 6,93 U/mg. Hoạt tính (U/L) 4500 3000 450 (B) 4000 (A) 400 2500 3500 350 2500 (U/l) hoạt tính U/l 250 (µg/ml) 3000 2000 300 Ho att inh [P] µg/ml No ng do P 2000 1500 200 1500 1000 150 1000 100 500 500 50 0 23 24 25 26 27 28 29 30 0 0 Phân đoạn 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Phân đoạn
Hình 3.9. Hoạt tính laccase-like tinh sạch của chủng XKBiR929. Hoạt tính
qua cột sắc ký lọc gel Sephadex G75 (A) và qua cột trao đổi ion trên hệ thống
Hitrap QHP (B)
Tuy nhiên, khi xác định trọng lượng phân tử bằng điện di trên gel polyacrylamide 15-20% (SDS-PAGE) để kiểm tra độ tinh sạch cũng như xác định khối lượng của protein thì khơng thấy xuất hiện “protein” được tinh sạch. Như vậy, phương pháp xác định sự tồn tại của laccase-like theo phương pháp tinh sạch protein laccase thông thường đã không xác định được trọng lượng phân tử của
laccase-like. Số liệu thu được đưa ta đến nhận định trọng lượng phân tử của laccase-like từ loài xạ khuẩn này nhỏ hơn 10 kDa.
Laccase-like kiểu mới này là sản phẩm được tạo ra bởi các chủng xạ khuẩn khơng phải là protein. Vì, sau khi đun sơi dịch ni cấy vài giờ vẫn xác định được khả năng oxy hóa ABTS thành sản phẩm có màu xanh (Hình 3.10). Đây có thể là chất trao đổi có khả năng tham gia phản ứng oxy hóa các hợp chất hữu cơ vịng thơm, để khẳng định điều này sẽ cần rất nhiều nghiên cứu chi tiết tiếp theo để tìm hiểu rõ hơn về bản chất hóa học và hoạt động xúc tác của chất được sinh tổng hợp bởi chủng xạ khuẩn XKBiR929.
(A) (B) (C)
Hình 3.10. Phản ứng oxy hóa của
laccase-like tinh sạch với ABTS trong đệm KCl-HCl pH 1 sau 2 phút (A), 1 phút (B) và khơng có laccase-like (C)