1000 U/L Laccase
2.2.5. Xác định khả năngphânhủy chất diệt cỏ/dioxin
2.2.5.1. Đánh giá khả năng phân hủy chất diệt cỏ/dioxin bằng laccase thô
a) Phân hủy dịch chiết đất: Chủng nấm đảm đã được chọn ni cấy trong bình
trụ trên mơi trường TSH1, sau 7 ngày nuôi cấy sau khi đo xác định được hoạt tích laccase cao nhất sẽ tiến hành thu dịch, kiểm tra khả năng sinh tổng hợp các enzyme MnP, LiP, laccase và các enzyme khác như chitinase, protease. Dịch enzyme thô được bảo quản lạnh ở 4oC để phục vụ cho các nghiên cứu của luận án. Trong nghiên cứu khả
năng phân hủy DCĐ, laccase thô từ chủng nấm đảm được chọn có hoạt tính ban đầu 22.000 U/L đã được sử dụng để tiến hành khảo sát khả năng phân hủy trực tiếp với DCĐ trong môi trường đệm acetate 20 mM, pH 3 (Buff) và bổ sung chất gắn kết ViO 10 mM (CGK), thành phần phản ứng được thực hiện trong lọ penil với thể tích là 10 ml (lọ được khử trùng khô ở 160oC trong 3 h). Thành phần các cơng thức thí nghiệm như sau:
Cơng thức VSE (µL) V EF (µL) VBuff (µL) V CGK (µL) EFSE1 1.000 2.000 0 0 EFSE2 1.000 2.000 500 0 EFSE3 1.000 2.000 500 500 EFSE4 1.000 2.000 0 500 EFSE5 (đối chứng) 1.000 0 500 0
Chú thích: VEF: Thể tích enzyme thơ từ chủng FBV40;VSE: Thể tích DCĐ;VBuff:
Thể tích đệm acetate 20 mM, pH 3.
Sự biến động hoạt tính enzyme được xác định theo thời gian đến khi hoạt tính enzyme mất hồn tồn.
b) Phân hủy 2,4,5-Trichlorophenoxy acetic acid: sử dụng 5 g/L chất diệt cỏ
2,4,5-T tinh khiết để tiến hành thí nghiệm (chất T) (VT), laccase thơ chủng nấm nghiên cứu có hoạt tính ban đầu 29.500 U/L (VEF), môi trường cho phản ứng phân hủy gồm 20 mM đệm acetate, pH 3 (Buff) (VBuff ), với sự có mặt của ViO (CGK) (VCGK) tất cả được thực hiện trong lọ penil 10 ml. Thành phần các công thức nghiên cứu như sau:
Cơng thức VT (µL) V EF (µL) V Buff (µL) V CGK (µL) EFT1 500 2.000 0 0 EFT2 500 2.000 500 0 EFT3 500 2.000 500 500 EFT4 500 2.000 0 500 EFT5 (đối chứng) 500 0 500 0
Mỗi công thức nghiên cứu được lặp lại 2 lần. Trong quá trình đánh giá mức độ phân hủy, sự biến động hoạt tính laccase được xác định theo thời gian.
c)Phân hủy 2,4-D; 2,4,5-T trong đất ơ nhiễm tại sân bay Biên Hồ ở quy mơ
phịng thí nghiệm: Cân 100 g đất ơ nhiễm lấy tại sân bay Biên Hịa vào bình trụ 250
ml và khử trùng ở 115oC trong 30 phút. Mẫu đất ô nhiễm được bổ sung 70 ml dịch enzyme thô từ chủng nấm nghiên cứu có hoạt tính ban đầu là 11.561 U/L. Đối chứng để xác định mức độ phân hủy thì bổ sung 70 ml dịch laccase thơ bất hoạt ở nhiệt độ 80oC trong 10 phút. Mẫu đối chứng để xác định sự biến động hoạt tính laccase sử dụng 100 g cát đã được rửa sạch bằng nước, sấy ở 160oC, rửa bằng n-
hexan, để khô. Bổ sung 70 ml dịch laccase thô như trên. Xác định sự biến động hoạt tính laccase theo thời gian.
2.2.5.2. Đánh giá phân hủy chất diệt cỏ/dioxin bằng chủng nấm sinh tổng hợp laccase
a) Phân huỷ 2,4,5-T trong đất ô nhiễm tại sân bay Biên Hoà bằng đơn chủng FBV40: Cân 10 g đất ô nhiễm đã được nghiền nhỏ, sấy khô thu thập từ sân bay Biên Hịa
vào bình trụ 250 ml. Bổ sung 100 ml môi trường TSH1 và khử trùng ở 115oC trong 30 phút. Bổ sung 3% giống từ chủng nấm theo thể tích mơi trường ni cấy. Mẫu đối chứng khơng bổ sung chủng giống mà bổ sung thêm 3% nước cất khử trùng. Mẫu được nuôi lắc với tốc độ 120 vòng/phút ở nhiệt độ 30oC. Mẫu đối chứng để đánh giá sự biến động hoạt tính laccase thì khơng chứa đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin. Khi hoạt tính laccase trong mẫu phân hủy bị mất hồn tồn, mẫu nghiên cứu được sấy khơ ở 50oC và nghiền nhỏ.
b)Phân huỷ chất diệt cỏ 2,4-D, 2,4,5-T trong đất ơ nhiễm tại sân bay Biên Hồ bằng đơn chủng FBV40 và hỗn hợp chủng (FBV40, FBD154 và FNBLa1): Cân 10 g
đất (bao gồm 2 g đất ô nhiễm nghiền nhỏ và 8g cát được rửa sạch bằng n-hexan và nước). Bổ sung 100 ml môi trường nuôi cấy TSH1 đem khử trùng ở 115oC trong 15 phút. Bổ sung 15% đơn chủng nấm đảm đã chọn theo thể tích và hỗn hợp chủng nấm đã chọn:FBD154:FNBLa1 (theo tỷ lệ 1:1:1). Đối chứng để đánh giá khả năng phân hủy khơng bổ sung chủng giống mà chỉ có nước cất. Đối chứng nghiên cứu quá trình sinh tổng hợp laccase và sự biến động hoạt tính theo thời gian khơng bổ sung đất ô nhiễm. Mẫu được nuôi lắc với tốc độ 120 vịng/phút ở nhiệt độ 30oC. Khi hoạt tính laccase trong mẫu nghiên cứu phân hủy mất hoàn toàn, mẫu nghiên cứu đem sấy khơ ở 50oC sau đó tiến hành phân tích bằng GC-MS.
c) Phân hủy đồng loại 2,3,7,8-TCDD bằng đơn chủng nấm đảm được chọn và hỗn hợp chủng nấm ( nấm đảm được chọn, FBD154 và FNBLa1): Sử dụng môi trường
nuôi cấy TSH1 100 ml, khử trùng ở 115oC trong 15 phút. Bổ sung 2,3,7,8-TCDD hoà tan trong DMSO đạt nồng độ cuối 2.000 ng TEQ/L. Bổ sung 15% theo thể tích mơi trường ni cấy dung dịch đơn chủng nấm được chọn và hỗn hợp chủng nấm được chọn , FBD154 và FNBLa1 với tỷ lệ thể tích 1:1:1. Mẫu đối chứng để đánh giá khả năng phân hủy bởi vi sinh vật nên đã không bổ sung chủng giống. Đối chứng để đánh giá khả năng sinh tổng hợp laccase thì khơng bổ sung 2,3,7,8-TCDD. Mẫu ni lắc với tốc độ 120 vịng/phút ở 30oC. Khi hoạt tính laccase trong mẫu mất hồn tồn thì kết thúc ni cấy và chuyển mẫu đến phịng thí nghiệm để phân tích bằng GC-MS.
2.2.5.3. Phương pháp phân tích để xác định khả năng phân hủy chất diệt cỏ/dioxin a) Phân tích xác định các thành phần trong dung dịch sau phân hủy DCĐ
Thành phần của chất diệt cỏ/dioxin trong mẫu nghiên cứu được chiết theo quy trình sau: (1) Kiểm tra pH của dung dịch nuôi cấy (mẫu) bằng giấy chỉ thị pH, chỉnh đến pH ~7 - 8. (2) Siêu âm mẫu trong bể siêu âm khoảng 15 phút. (3) Bổ sung dichloromethane vào mẫu theo tỷ lệ 1:2 (v/v). Lắc hỗn hợp ở tốc độ lắc 300 vòng/phút trong 30 phút. Để lắng, tiếp tục lắc ở tốc độ lắc 300 vòng/phút trong 30 phút. Gạn lấy phần dung dịch và lọc lấy phần dichloromethane, để riêng. (4) Điều chỉnh pH phần dung dịch đến pH<2 bằng H2SO4 6N. Tiếp tục bổ sung dichloromethane và lắc như bước 3. Gạn, lọc lấy phần dichloromethane. (5) Gộp toàn bộ phần dichloromethane và làm khan bằng Na2SO4. (6) Cô đuổi dung môi trên máy cất quay đến V~0,5 ml. Chuyển phần còn lại vào ống nghiệm, làm bay hơi đến khơ phần dung mơi cịn lại bằng dịng khơng khí nóng. Định mức chính xác bằng MeOH. (7) Chạy SIM trên thiết bị Sắc ký khí khối phổ để xác định thành phần định tính mẫu nghiên cứu trên máy sắc ký khí Agilent GC 7890A ghép khối phổ MSD 5975C tại Trung tâm Nhiệt đới Việt - Nga/BQP với chương trình: nhiệt độ đầu 600C trong 1 phút, tăng nhiệt 80C/phút đến 3200C, giữ ở nhiệt độ này trong
5 phút. Nhiệt độ Injector 2800C, Interface 2800C. Bơm 1µl dung dịch mẫu theo kiểu khơng chia dịng (Spliless). Detector hoạt động theo chế độ quét (scan) từ 35 đến 550 amu. Cột phân tích DB5-MS (60m x 250µm x 0,25µm).
b) Phân tích xác định 2,4,5-T trong dung dịch
Tồn bộ thể tích dung dịch thí nghiệm được đưa vào bình cầu 250 ml, cân 3,6 g KOH vào bình cầu, bổ sung một vài hạt sơi. Đun hồi lưu trong 2 h trên bếp cách thủy. Để nguội đến nhiệt độ phòng và chuyển vào phễu chiết loại 250 ml. Chiết với dichlometan 3 lần, tổng thể tích dichlometan trong 3 lần chiết là 100 ml, bỏ phần dung mơi chiết. Phần dung dịch cịn lại thêm 25 ml H2SO4 18N lắc trong 2 phút, để yên 10 phút. Chiết 2,4,5-T sang pha hữu cơ bằng dietyl ete 3 lần, tổng thể tích dietyl ete sau 3 lần chiết là 100 ml. Tráng rửa bình cầu và phễu chiết sử dụng 5 ml dietyl ete. Tập hợp dịch chiết dietyl ete vào bình nón dung tích 250 ml, cho 10 g Na2SO4
khan vào bình nón, lắc nhẹ để bay hơi trong khoảng 2 h hoặc để qua đêm. Lọc dịch lọc đã được làm khơ qua phễu, tiếp tục rửa bình nón và Na2SO4 bằng 5 ml dietyl ete. Tập hợp pha hữu cơ vào bình cầu loại 250 ml và cất quay tại 30oC đến 5
ml. Chuyển dịch cất quay sang bình quả nhót 25 ml, tráng bình. Lắp bình quả nhót và cất quay để bay hơi cịn 1 ml. Cho bay hơi tự nhiên trong tủ hút đến khô. Dùng 1 ml axeton nitril để hòa tan cặn chiết, lọc qua màng siêu lọc và phân tích trên máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Agilent HP-1100, detector UV-VIS, cột SB-C18 (4,5 x 150 mm, 5 µm) tại Viện Hóa học-Mơi trường quân sự/BTL Hóa học với pha động ACN:H20:axit, tốc độ dòng 1ml/phút. Nhiệt độ cột 300C, tín hiệu đo λ = 280 nm.
c) Phân tích xác định 2,4-D, 2,4,5-T trong đất
Cân 5g đất đã được đồng nhất vào túi đựng mẫu và đặt vào bộ chiết soxhlet. Cho 200 ml dung mơi aceton vào bình cầu 500 ml và một ít hạt sơi. Chiết trong 8 h liên tục. Để nguội, cất quay ở 40oC với áp suất chân không để đạt 1 ml. Bổ sung 50 ml dung dịch KOH, đun hồi lưu trong 2 h trên bếp cách thủy. Các bước tiếp theo được thực hiện như quy trình phân tích xác định 2,4,5-T trong dung dịch được mô tả ở trên. Hàm lượng 2,4-D, 2,4,5-T trong đất được xác định theo TCVN 6134:2009 với detector UV-VIS, cột SB-C18 (4,5 x 150 mm, 5 µm), pha động ACN:H20: axit, tốc độ dịng 1ml/phút, nhiệt độ cột 300C, tín hiệu đo λ = 280 nm trên máy HPLC Agilent HP-1100 của Viện Hóa học - Mơi trường quân sự/BTL Hóa học, hoặc trên máy sắc ký lỏng khối phổ ba lần tứ cực Agilent 6430 Triple Quad LC/MS tại Trung tâm Nhiệt đới Việt - Nga/Bộ quốc phịng.
d) Phân tích xác định đồng loại 2,3,7,8-TCDD trong dung dịch
Toàn bộ dung dịch nghiên cứu được thêm chất nội chuẩn 13
C12-PCDD/PCDF lắc nhẹ trong 30 giây, lọc mẫu qua phin lọc. Thu hồi phin lọc và phần dung dịch lỏng đi qua. Q trình phân tích được thực hiện trên cái lọc và trong pha lỏng. Cái lọc và phần cặn trên cái lọc được chiết soxhlet trong vịng 24 h với dung mơi toluen. Phần dung dịch lọc được chiết bằng 60 ml dung mơi diclomethane, q trình chiết được lặp lại 3 lần. Gộp dung dịch chiết từ hai quá trình trên vào làm một, thêm chất chuẩn làm sạch 37Cl4 - 2,3,7,8-TCDD tiến hành cô đặc về gần khơ bằng cất quay. Hịa tan bằng 1 ml dung dịch n-hexan. Làm sạch dung dịch trên qua cột silicagel đa lớp sau đó làm sạch qua cột than. Thêm chất chuẩn
13C12-PCDD/PCDF. Cô đặc dung dịch về 1 ml, thêm 100 µl dung mơi nonan. Dùng dịng khí nitơ thổi nhẹ đưa dung dịch về 100 µl. Mẫu được phân tích trên máy GC 6890, MS 5975 Agilent tại Viện Hóa học - Mơi trường qn sự/BTL Hóa học.