40 MN.FBN (LM- loại MN.FBN (LM- loại K hả 2000 20 màu, HT- hoạt tính) 0 0 0 2 4 6 8 10 Thời điểm
LM MY.EG LM MY.BES LM MN.FBN HT MY.EG
Abs 0.8 0.65 0.5 0.35 0.2 300 400 500 600 700 800 nm Ab s 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 300 400 500 600 700 800 nm
Hình 3.30. Phổ UV-Vis của MN.FBN trong môi trường sau 1 ngày (A) và sau 4
ngày (B) ni cấy với FBV40
(A) (B)
Hình 3.31. Sự thay đổi màu MN.FBN trong môi trường nuôi cấy với FBV40 sau 1
ngày (A) và sau 4 ngày (B)
Một số nghiên cứu của các tác giả trên thế giới và trong nước đã chứng minh, các hợp chất vòng thơm với cấu trúc giống lignin như xylidine, ferulic acid và veratric acid được bổ sung trong q trình ni cấy các chủng nấm có khả năng làm gia tăng quá trình sinh tổng hợp laccase [174, 124]. Gần đây các nhà khoa học đã chỉ ra, trong quá trình phân huỷ lignin bởi laccase từ chủng nấm có khả năng tạo ra các các hợp chất vịng thơm, các hợp chất này có thể làm gia tăng quá trình sinh tổng hợp laccase [150]. Veratryl (3,4-dimethoxybenzyl) alcohol là hợp chất vòng thơm được biết đến với vai trò quan trọng trong quá trình phân huỷ lignin. Sự bổ sung chất này vào môi trường nuôi cấy của nhiều chủng nấm trắng đã làm tăng quá trình sinh tổng hợp laccase [41]. Hoạt tính laccase cao nhất thu được khi nghiên cứu đối với loài Botryosphaeria
rhodina khi bổ sung veratryl alcohol vào mơi trường ni cấy khi q trình ni cấy
bắt đầu. Với loài R. lignosus hoạt tính laccase sinh ra cao nhất khi bổ sung phenylhydrazine [14]. Trong nghiên cứu của Elisashvili và Kachlishvili, TNT (2,4,6- trinitrotoluene) được bổ sung trong mơi trường ni cấy với nồng độ thích hợp làm tăng khả năng sinh tổng hợp laccase của loài Cerrena unicolor và hoạt tính tăng lên gấp 4 lần so với mơi trường ni cấy khơng có TNT [65]. Xylidine được chứng minh là có ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp laccase đối
với hai loài Trametes villosa [174] và Trametes versicolor [136]. Sự bổ sung veratryl alcohol trong môi trường nuôi cấy của nhiều chủng nấm trắng và kết quả cuối cùng là đã làm tăng khả năng sinh tổng hợp laccase [6, 136].
Như vậy, với những minh chứng thực nghiệm thu được càng làm sáng tỏ khả năng của thuốc nhuộm MN.FBN như là tác nhân làm tăng khả năng sinh tổng hợp laccase ở chủng FBV40. Bên cạnh đó, khả năng loại màu bởi chủng nấm đảm này rất cao tới 99% sau 7 ngày ni cấy và khơng có sự hấp phụ màu vào trong quả thể nấm. Kết quả thu được này rất mới, có ý nghĩa để lựa chọn đúng trong nghiên cứu cơng nghệ loại màu thuốc nhuộm tổng hợp nói chung và thuốc nhuộm hoạt tính thương mại nói riêng ở qui mô công nghiệp.
3.3.2.2. Loại màu thuốc nhuộm MN.FBN ở các nồng độ khác nhau
Để tìm hiểu rõ hơn khả năng của chủng FBV40 trong việc loại màu thuốc nhuộm MN.FBN, nghiên cứu loại màu ở các nồng độ thuốc nhuộm khác nhau đã được tiến hành. Kết quả loại màu và sự thay đổi hoạt tính laccase thơ sinh tổng hợp trong quá trình nghiên cứu được trình bày ở Hình 3.32 và Hình 3.33.
Sau 1 đến 3 ngày ni cấy chủng FBV40 loại màu thuốc nhuộm MN.FBN có nồng độ 100 mg/L đạt từ 52,7 % đến 97,3 %, trong khi ở nồng độ thuốc nhuộm 50 và 200 mg/L thì hiệu suất loại màu đạt tương ứng từ 49,8 % đến 94,3% và 35,2 % đến 97,1 %. Tương ứng, hoạt tính laccase được sinh tổng hợp trong q trình ni cấy chứa 100 mg/L thuốc nhuộm là 1.502 U/L sau 4 ngày. Như vậy, chủng nấm FBV40 có khả năng loại màu cao nhất trong mơi trường có nồng độ thuốc nhuộm 100 mg/l.
Khả năgn loại màu (%) 100 80 60 40 20 0 0 1 LM 50 mg/L HT 50 mg/L 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 2 3 4 5 Thời điểm LM 100 mg/L LM 200 mg/L HT 100 mg/L HT 200 mg/L H oạ t t ín h (U /L )
Hình 3.32. Hiệu suất loại MN.FBN và biến động hoạt tính laccase của FBV40
(A) (B) (C)
Hình 3.33. Sự thay đổi màu MN.FBN bằng chủng FBV40 ở các nồng độ thuốc nhuộm
50, 100 và 200 mg/L sau 1 ngày (A), 2 ngày (B) và sau 3 ngày (C)
3.3.2.3. Loại màu thuốc nhuộm MN.FBN khi có mặt D-glucose bằng ni cấy FBV40
Để tiếp tục nghiên cứu vai trị của D-glucose trong q trình loại màu thuốc nhuộm MN.FBN bằng chủng FBV40. Môi trường ni cấy sử dụng nước cất và có bổ sung D-glucose với hàm lượng từ 0 đến 3 g/100 ml và 100 mg/L thuốc nhuộm MN.FBN. Mức độ loại màu bởi chủng FBV40 được trình bày ở Hình 3.34. Sau 1 ngày ni cấy thì hiệu suất loại màu thuốc nhuộm MN.FBN bởi FBV40 đạt rất cao từ 31 đến 97%, đối với mơi trường khơng có D-glucose thì hiệu suất chỉ đạt 8%. Sau 5 ngày ni cấy thì hiệu suất loại màu đạt cao nhất đạt gần 100% ở 0,5 g/100 ml D-glucose. Kết quả nghiên cứu cho thấy khi hàm lượng D-glucose tăng từ 0,1 g/100 ml đến 2 g/100 ml mơi trường thì hiệu suất loại màu giảm đi sau 1 đến 2 ngày ni cấy.
Sự biến động hoạt tính laccase sinh ra bởi FBV40 cho thấy, khi không bổ sung D-glucose hoạt tính laccase giảm khơng đáng kể trong q trình ni cấy, sau 11 ngày hoạt tính vẫn cịn 121 U/L so với 184,6 U/L (giảm 34,4%). Khi bổ sung D- glucose vào mơi trường ni cấy thì hoạt tính laccase giảm rất nhanh sau 1 ngày nuôi cấy và gần như không thay đổi ở các ngày nuôi cấy tiếp theo.
10090 90 80 0,0 g (% ) 0,1 g 70 0,3 g m àu 60 0,5 g 0,7 g lo ại 50 1,0 g nă ng 40 2,0 g 30 (A) 3,0 g K hả 20 10 0 1 2 3 4 5 7 11
Thời gian (ngày)
200(U (U /L ) 150 0,0 g 0,1 g tí nh 100 0,3 g (B) 0,5 g Ho ạt 0,7 g 50 1,0 g 2,0 g 3,0 g 0 1 2 3 4 5 7 11
Thời gian (ngày)
Hình 3.34. Khả năng loại màu bằng nuôi cấy FBV40 với nồng độ
D-glucose khác nhau (A) và sự biến động hoạt tính laccase (B) Theo một số nghiên cứu, nguồn carbon được sử dụng phổ biến nhất đối với các chủng nấm trắng là glucose. Ở hàm lượng 10 g/l glucose sẽ tăng cường sự sinh trưởng và khả năng sinh laccase bởi loài Coriolus versicolor. Đối với lồi Trametes
versicolor thì hàm lượng glucose cao hơn 20 g/L sẽ sinh tổng hợp laccase cao hơn
[94]. Đối với loài Ganoderma lucidum với 20 g/L glucose đã làm tăng sự sinh trưởng của hệ sợi, nhưng với hàm lượng 10 g/L thì quá trình sinh tổng hợp laccase tốt hơn [119]. Hàm lượng glucose tối ưu để sinh tổng hợp laccase ngoại bào ở các loài Lentinula edodes và Grifola frondosa nuôi cấy trong môi trường lỏng là 10 g/L [17, 124]. Với 5g/L glucose có trong mơi trường lỏng ni cấy lồi Trametes
gallica là phù hợp để sinh laccase đối với chủng [37].
Dhawan và Kuhad cũng đã công bố, khi bổ sung cồn vào trong môi trường nuôi cấy đã làm tăng khả năng sinh tổng hợp laccase của loài nấm Trametes
versicolor. Hoạt tính laccase cũng được tăng lên khi sử dụng 2,5-xylidine và
veratryl alcohol. Nguyên nhân của hiện tượng được giả thuyết rằng, khi bổ sung ethanol vào môi trường nuôi cấy làm giảm khả năng hình thành melanin, khi melanin ở nồng độ thấp sẽ đóng vai trị như một chất cảm ứng đối với quá trình sinh tổng hợp laccase cịn khi nó ở nồng độ cao sẽ gây ức chế quá trình sinh tổng hợp laccase [75]. Theo một nghiên cứu khác chứng minh rằng, ethanol đã nâng cao quá trình sinh tổng hợp laccase lồi Pycnoporus cinnabarinus khi được sử dụng như là nguồn carbon. Các nghiên cứu chi tiết về chủng này đã chỉ ra rằng ethanol đã góp phần biểu hiện gene ngăn cản các hoạt động phân huỷ protein và đóng vai trị quan trọng trong việc sinh tổng hợp laccase [92]. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh hoạt động của các chất cảm ứng có thể gây độc cho chủng nấm và khả năng sinh tổng hợp laccase. Tuy nhiên, việc sử dụng các chất cảm ứng có thể ảnh hưởng đến sinh trưởng của nấm như độ độc của chúng và tốn thêm chi phí [170].
Số liệu thu được của luận án cùng với cơng bố quốc tế thì D-glucose có thể là nguồn carbon hoặc là chất cảm ứng hoặc là CGK thích hợp để q trình loại màu thuốc nhuộm MN.FBN bởi chủng nấm đảm FBV40 đạt hiệu quả cao hơn.
3.3.2.4. Loại màu thuốc nhuộm MN.FBN khi có mặt các loại đường khác nhau
Để tiếp tục đánh giá vai trò của D-glucose trong phản ứng loại màu MN.FBN bằng chủng FBV40. Môi trường ni cấy là nước cất có bổ sung 1 g/L các loại đường D-glucose, sacharose, manos, lactose và 100 mg/L thuốc nhuộm MN.FBN. Kết quả được trình bày ở Hình 3.35 và phổ UV-Vis ở Hình 3.36. Khi sử dụng các loại đường làm nguồn carbon và năng lượng thì D-glucose đạt hiệu suất loại màu cao nhất là 96% sau 8 ngày nuôi cấy, tiếp đến là lactose đạt 90%,
sacharose đạt 87%, mannose là 74% so với đối chứng thì hiệu suất chỉ đạt 28% sau 9 ngày nuôi cấy.
Bảng 3.10. Biến động hoạt tính laccase trong q trình loại màu thuốc nhuộm
MN.FBN bởi FBV40 trong môi trường nuôi cấy chứa các loại đường khác nhau
Loại đường Biến động hoạt tính laccase theo thời gian (U/L) (ngày)
1 2 3 6 7 8 9 Ko bổ sung 131,0 133,6 168,0 127,5 122,0 90,0 74,0 D-glucose 128,8 28,2 9,8 2,0 2,0 1,0 1,0 Sacharose 137,1 17,5 10,0 1,0 1,0 1,0 1,0 Mannose 130,2 71,7 62,1 2,0 2,0 3,0 2,0 Lactose 130,7 47,0 15,0 29,2 46,0 44,6 60,9