Khảnăng phânhủy 2,4-D, 2,4,5-T bởi các chủng đơn và hỗn hợp vi khuẩn đã
2.2.3. Phương pháp hóa-sinh
2.2.3.1. Xác định hoạt tính laccase, laccase-like sử dụng ABTS
Nguyên tắc: Hoạt độ của laccase được xác định bằng sự tăng độ hấp thụ ánh
sáng của sản phẩm được tạo thành ở bước sóng 420 nm ở điều kiện phịng thí nghiệm.
Định nghĩa: Một đơn vị hoạt độ laccase là lượng enzyme cần thiết để tạo thành
1 µM sản phẩm từ cơ chất ABTS trong thời gian 1 phút, ở điều kiện phịng thí nghiệm.
Phương pháp xác định:
Bước 1: Hút các thành phần phản ứng gồm 600 µl đệm natri acetate (20 mM, pH 4), 200 µl dịch enzyme.
Bước 2: Xác định độ hấp thụ ánh sáng (AC) của dung dịch tại thời điểm τ = 0: Hút 200 µl ABTS 1,5 mM vào ống nghiệm đã chứa các thành phần ở bước 1, voltex đều và chuyển sang cuvet, xác định giá trị độ hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 420 nm.
Bước 3: Xác định giá trị độ hấp thụ ánh sáng (AM) của dung dịch phản ứng tại thời điểm τ: Hút 200 µl ABTS 1,5 mM vào ống nghiệm đã chứa các thành phần ở bước 1, voltex đều, trong thời gian τ (thường là 2 phút). Xác định giá trị độ hấp thụ ánh sáng
ở bước sóng 420 nm. Lặp lại 2-3 lần để lấy giá trị độ hấp thụ ánh sáng trung bình. Cơng thức tính:
U = (AA)V 106 D (CT1)
MC pu f
VE
Trong đó:
U: Hoạt độ enzyme (U/l)
ε: Hệ số hấp thụ ánh sáng của sản phẩm, ε420 = 36.000 (M-1 cm-1) Vpu: Tổng thể tích phản ứng (1 ml)
VE: Thể tích enzyme (200 µl)
Aτ: Giá trị độ hấp thụ ánh sáng đo được tại thời điểm τ A0: Giá trị độ hấp thụ ánh sáng đo được tại thời điểm τ = 0 Df: Độ pha loãng.
Tpu: Thời gian phản ứng (2 phút)
2.2.3.2. Tinh sạch, nhận diện protein của laccase, laccase- like a) Tinh sạch bằng cột lọc gel
- Đối với dịch laccase thơ thu từ q trình ni cấy được ly tâm 4,000 vịng/phút trong 15 phút ở 4ºC được cô đặc bằng màng lọc tiếp tuyến 10 kDa. Dịch enzyme sau
khi cơ được đưa lên cột sắc kí lọc gel Sephadex G-75 với thể tích 2 ml/lần. Cột có kích thước 1,2 x 50 cm được cân bằng với đệm 20 mM sodium acetate; pH 5,5; tốc độ dòng chảy là 20 ml/giờ. Thu 40 phân đoạn, thể tích mỗi phân đoạn 1 ml. Hàm lượng protein và hoạt tính enzyme được xác định trong mỗi phân đoạn.
- Đối với dịch laccase-like thô của chủng XKBiR929 được cô bằng thiết bị cất quay ở nhiệt độ 80ºC và áp suất 0,8 atm. Dịch laccase-like sau khi cơ được đưa lên cột sắc kí lọc gel Sephadex G-10 với thể tích 2 ml/lần. Cột có kích thước 1,2x50 cm được cân bằng với đệm 20 mM sodium acetate; pH 5,5; tốc độ dòng chảy là 20 ml/giờ. Thu 35 phân đoạn từ lúc dịch enzyme ở độ cao ½ cột, thể tích mỗi phân đoạn 1 ml. Hàm lượng protein và hoạt tính enzyme được xác định trong mỗi phân đoạn.
b) Tinh sạch bằng cột trao đổi ion
Dịch enzyme sau khi qua cột sephadex G-75, G-10, chọn những phân đoạn có hoạt tính laccase cao được đưa tiếp lên cột sắc ký trao đổi ion Q – anion với tổng thể tích là 10 ml. Cột có kích thước 1 x 5 cm được cân bằng với đệm 20mM sodium acetate pH 5,5. Thôi mẫu bằng muối 0,05-0,5 M NaCl, bước nhảy giữa các nồng độ là 0,05 M; mỗi nồng độ thu 10 phân đoạn với thể tích 1 ml/phân đoạn. Tốc độ dòng chảy là 1 ml/phút khi cân bằng cột và load mẫu; 1,5 ml/ phút khi thôi mẫu. Hàm lượng protein và hoạt tính enzyme được xác định ở mỗi phân đoạn.
c) Xác định hàm lượng protein tổng số
Hàm lượng protein được xác định bằng phương pháp Bradford (1976). Phương pháp này dựa trên nguyên tắc: các protein khi phản ứng với Coomassie Brilliant Blue sẽ hình thành phức hợp màu có khả năng hấp thụ ánh sáng mạnh nhất ở bước sóng 595 nm, cường độ màu tỉ lệ thuận với nồng độ protein trong dung dịch. Hàm lượng protein tổng số được xác định dựa vào đồ thị chuẩn protein từ dung dịch BSA (Bovin Serum Albumin).
Dung dịch chuẩn BSA có nồng độ stock 100 µg/ml được sử dụng để xây dựng đường chuẩn protein. Sử dụng nước khử ion để pha loãng các nồng độ BSA khác nhau 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60 và 70 µg/mL. Giá trị OD được xác định ở bước sóng 595 nm. Thí nghiệm được tiến hành trong đĩa 96 giếng. Nồng độ protein được xác định dựa trên đường chuẩn BSA.
d) Điện di SDS-PAGE [77]
Để xác định khối lượng phân tử và độ tinh sạch của laccase được xác định bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide. Quá trình điện di được thực hiện với dịng điện có hiệu điện thế là 90V đối với bản điện di gel cô và 120 V đối với bản điện di gel tách. Thành phần của gel điện di gồm:
Thành phần Gel tách 12,5% Gel cô 4,5%
H2O 0,67 ml 0,11 ml Tris HCl 1,5 M (pH 8,8) 1,375 ml - Tris HCl 0,5 M (pH 6,8) - 0,5 ml Glycerol 50% 1,1 ml - Bis/acrylamide 2,31 ml 0,35 ml SDS 10% 55 μl 10 μl APS 37 μl 20 μl TEMED 4 μl 3 μl
2.2.3.3. Xác định đặc tính protein của laccase, laccase-like tinh sạch
a) Ảnh hưởng pH thích hợp và độ bền pH: dịch enzyme tinh sạch được ủ với
cơ chất ABTS pha trong dải đệm có pH từ 2 đến 6, bao gồm đệm: glycine-HCl với pH từ 2-3; sodium acetate với pH từ 4-5 và potassium phosphate với pH từ 6-7. Để đánh giá độ bền pH, laccase được ủ với các đệm có pH thay đổi từ 2-7 trong thời gian 7 giờ ở nhiệt độ 30oC.
b)Ảnh hưởng nhiệt độ thích hợp và độ bền nhiệt: hỗn hợp phản ứng bao gồm
dịch enzyme, cơ chất ABTS, đệm pH thích hợp được ủ ở các nhiệt độ khác nhau trong khoảng từ 30 - 90ºC để tìm nhiệt độ phản ứng thích hợp. Để xác định độ bền nhiệt của enzyme từ chủng nấm nghiên cứu, dịch enzyme đã tinh sạch được ủ ở các nhiệt độ khác nhau từ 30 - 90ºC, sau các khoảng thời gian: 20, 60, 100, 140 và 180 phút. Hoạt tính cịn lại của enzyme được xác định theo phương pháp đã nêu với thời gian phản ứng là 2 phút ở nhiệt độ phản ứng tương ứng.
c) Cơ chất đặc hiệu: một số cơ chất đặc hiệu thường được sử dụng đối với
enzyme là ABTS; syringaldazine (syrin); 2, 6-DMP và guaiacol (Gua), được sử dụng để kiểm tra khả năng phản ứng oxy hóa của laccase tinh sạch. Hỗn hợp phản ứng gồm 600 µl đệm 20 mM sodium acetate pH 4, 200 µl enzyme tinh sạch và 200 µl cơ chất. Sự oxi hóa của cơ chất được xác định trong khoảng bước sóng từ 340- 700 nm. Tốc độ oxi hóa cơ chất bởi enzyme được xác định bằng sự tăng độ hấp thụ ánh sáng tại bước sóng xác định. Mỗi phép đo được lặp lại 2 lần.
d) Xác định hằng số Michaelis-Menten (Km) và Vmax: Dịch enyzme tinh sạch
được cho phản ứng với cơ chất ABTS có nồng độ khác nhau: 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 và 0,5 mM. Ứng với mỗi nồng độ cơ chất được khảo sát ở thời gian 2 phút, phản ứng được thực hiện ở 60oC, xác định hoạt tính laccase. Ở mỗi nồng độ cơ chất chọn giá trị hoạt tính cao nhất làm giá trị V. Từ đó dùng phần mềm Excel để vẽ đồ thị Lineweaver-Burk theo nồng độ cơ chất [S] và giá trị hoạt tính V tương ứng. Từ đó xác định được Km và Vmax.
e) Ảnh hưởng của các chất ức chế và ion kim loại: dịch enzyme được ủ cùng
với muối của các kim loại: Ni2+, K+, Na+, Cu2+, Fe2+, Mn2+, Mg2+, Ca2+, Co2+
ở nồng độ 0,5; 1, 2, 3, 4 và 5 mM. Một số chất ức chế (Cl-, EDTA, SDS, arginine) được sử dụng ở nồng độ 2, 5 và 10 mM. Sau 30 phút, hoạt tính cịn lại của enzyme được xác định. Hỗn hợp phản ứng được thực hiện ở nhiệt độ 60oC và pH 4.
Mẫu đối chứng khơng có mặt của ion kim loại hoặc chất ức chế. Hoạt tính được biểu diễn bằng phần trăm hoạt tính cịn lại hoặc % bị ức chế. Hoạt tính enzyme ở mẫu đối chứng được coi là 100%. Mỗi phép đo được lặp lại 2 lần.