K ob sung ổ D-gluco
3.3.3. Phânhủy chất diệt cỏ/dioxin bởi laccase và nấm sinh tổng hợp laccase
3.3.3.1. Phân huỷ chất diệt cỏ/dioxin bởi laccase thô a) Phân hủy dịch chiết đất
Dịch chiết đất là dung dịch được chiết bằng dung môi với đất ô nhiễm nặng chất diệt cỏ/dioxin tại sân bay Biên Hịa, trong đó có chứa các chất diệt cỏ, các đồng loại của dioxin và các hợp chất hữu cơ khác. Mục đích của các nghiên cứu thuộc chun ngành cơng nghệ mơi trường là tìm được các tác nhân có khả năng phân hủy cao không chỉ đơn chất ơ nhiễm mà bài tốn thật là tổ hợp các chất ơ nhiễm. Chính vì vậy, DCĐ được xác định là đối tượng phù hợp để xác định khả năng phân hủy của laccase. Khi hoạt tính laccase trong mẫu giảm đi 98%, các mẫu nghiên cứu được phân tích bằng thiết bị GC-MS ở chế độ chạy quét phổ để xác định các thành phần hợp chất có trong mẫu, trong đó tập trung vào xác định khả năng phân hủy các chất diệt cỏ là 2,4-D và 2,4,5-T. Căn cứ sắc ký đồ, phổ khối lượng đã phân tích và trên cơ sở diện tích pick để tính tốn bán định lượng đối với 2,4-D và 2,4,5-T có trong các mẫu nghiên cứu. Sau 13 ngày, khả năng phân hủy 2,4-D và 2,4,5-T tương ứng đạt 65,46% và 85,71% ở cơng thức thí nghiệm EFSE3 (gồm có DCĐ, laccase thơ, đệm acetate 20 mM và ViO 10 mM) . Tại các cơng thức EFSE1 (gồm có DCĐ, laccase thơ), EFSE2 (gồm có DCĐ, laccase thơ và đệm acetate 20 mM), EFSE4 (gồm có DCĐ, laccase thơ và ViO 10 mM) không xác định được 2,4-D cũng như 2,4,5-T.
Mức độ giảm hoạt tính laccase diễn ra nhanh ở cơng thức thí nghiệm EFSE3, EFSE4 (Hình 3.39) . Sau 9 ngày, hoạt tính laccase đã giảm 96 - 97%, cịn ở cơng thức thí nghiệm EFSE1 và EFSE2 hoạt tính giảm từ 64 đến 25%. Như vậy, dựa trên kết quả thu nhận được có thể xác định sơ bộ laccasae có khả năng phân hủy 2,4-D, 2,4,5-T và vai trị của chất gắn kết, mơi trường (đệm) có ảnh hưởng tới khả năng phân hủy chất diệt cỏ 2,4-D và 2,4,5-T của laccase chủng FBV40. Kết quả thu nhận được là cơ sở để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo nhằm phân tích, đánh giá khả năng phân hủy chất diệt cỏ 2,4-D, 2,4,5- T nói riêng và các đồng loại của dioxin nói chung bởi laccase thơ từ chủng FBV40.
25,00020,000 20,000 15,000 (U/L)tính 10,000 Hoạt 5,000 0 EFSE1 EFSE2 EFSE3 EFSE4 EFSE5
ban đầu 9ngày 13ngày
Thời gian
Hình 3.39. Hoạt tính laccase theo thời gian xử lý
DCĐ b) Phân huỷ 2,4,5-T tinh khiết
Trên cơ sở kết quả khảo sát mức độ phân hủy DCĐ được trình bày ở trên, nghiên cứu đánh giá khả năng phân hủy 2,4,5-T tinh khiết với hàm lượng là 2,36 mg trong dung dịch phản ứng chứa 2 ml dịch laccase thơ chủng FBV40. Kết quả được trình bày ở Bảng 3.11.
Bảng 3.11. Khả năng phân hủy 2,4,5-T tinh khiết bằng laccase thơ chủng FBV40
Cơng thức thí nghiệm Hiệu suất
phân hủy 2,4,5-T (%)
EFT1 (2,4,5-T + laccase thô) 98,45
EFT2 (2,4,5-T + laccase thô + đệm acetate) 40,55 EFT3 (2,4,5-T + laccase thô + đệm acetate + ViO10 97,84 mM)
Ở các công thức nghiên cứu, laccase thơ chủng FBV40 đều có khả năng phân hủy đối với 2,4,5-T ở mức độ khác nhau nằm trong khoảng từ 40,55 đến 98,45% sau 20 ngày. Trong nghiên cứu này, thành phần của mơi trường có bổ sung đệm acetate 20 mM và CGK ViO 10 mM tương tự với thành phần khi nghiên cứu phân hủy DCĐ. Kết quả cho thấy sự ảnh hưởng của các thành phần môi trường không đáng kể tới khả năng phân hủy 2,4,5-T. Cụ thể là ở cơng thức EFT1 khi khơng có mặt đệm và ViO thì khả năng phân hủy của laccase đạt hơn 98%, giá trị này cũng gần tương tự với kết quả phân hủy 2,4,5-T trong mẫu có đệm và ViO ở cơng thức EFT3 là 97,84%. Khi nghiên cứu sự biến động hoạt tính laccase thơ theo thời gian ở các cơng thức thí nghiệm. Sau 15 ngày, hoạt tính laccase giảm nhanh ở cơng thức EFT3 và EFT4 lần lượt là 91 và 87%, trong khi đó ở cơng thức EFT1 hoạt tính giảm chậm hơn với 85%. Kết quả nghiên cứu cho thấy khả năng của laccase chủng
FBV40 đã phân hủy 2,4,5-T với hiệu suất cao lên đến 98,45% tương ứng 2,32 mg đã bị phân hủy sau 20 ngày xử lý (Hình 3.40).
35,000(A) 80.00 2.00 30,000 (B) (A) 80.00 2.00 30,000 (B) (% ) 60.00 1.500 25,000 Kh ản nă ng ph ân hủ y H oạ ttí nh (U /L ) cị nl i ạ Hà m lư ợn g( mg ) 40.00 1.00 20,000 EFHC1 2,4,5-T (mg) 15,000 EFHC2 % phân hủy 20.00 .500 EFHC3 10,000 EFHC4 .00 .00 5,000 1 2 3 4 5 2,4,5-T (mg) .0365 1.4010 .0420 .0430 2.3565 0
ban đầu 2 ngày 5 ngày 10 ngày 15 ngày 20 ngày % phân hủy 98.4511 40.5474 98.2177 98.1753
Thời gian
Hình 3.40. Hàm lượng và hiệu suất phân hủy 2,4,5-T (A), hoạt tính laccase
thơ theo thời gian (B)
c) Phân huỷ 2,4-D và 2,4,5-T có trong đất ơ nhiễm tại sân bay Biên Hịa
Để đánh giá khả năng phân hủy của laccase thô của chủng FBV40 đối với chất diệt cỏ 2,4-D và 2,4,5-T có trong đất ơ nhiễm tại sân bay Biên Hịa, tỉnh Đồng Nai. Nghiên cứu xử lý đã được thực hiện trong 27 ngày, kết quả được trình bày ở Bảng 3.12. Sau 27 ngày, 2,4-D có trong đất ơ nhiễm đã bị phân hủy 49,5% và 2,4,5- T bị phân hủy 37,71% với nồng độ ban đầu trong đất ô nhiễm rất cao tương ứng là 556,92 và 981,89 ppm (Bảng 3.15). Ngoài ra các chất tạo thành như 2,4-DCP và 2,4,5-TCP là các sản phẩm phân hủy tương ứng của 2,4-D cũng như 2,4,5-T cũng bị laccase thô phân hủy đáng kể là 100% và 71,16%. Minh chứng này đã khẳng định laccase thô từ chủng FBV40 đã phân hủy 2,4-D và 2,4,5-T có trong đất ơ nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tại sân bay Biên Hòa với hiệu suất cao, hàm lượng đã bị phân hủy lần lượt là 275,65 mg/kg và 370,26 mg/kg.
Bảng 3.12. Khả năng phân hủy chất diệt cỏ và các chất ô nhiễm khác bằng laccase thô
Hàm lượng chất ô Hàm lượng chất ô
Chỉ tiêu nhiễm trong đất đối nhiễm trong đất sau Hiệu suất phân hủy (%)
chứng (mg/kg) xử lý (mg/kg)
2,4-D 556,92 281,27 49,50
2,4,5-T 981,89 611,63 37,71
2,4-DCP 8,67 0 100
2,4,5-TCP 41,89 12,08 71,16
Nghiên cứu sự biến động hoạt tính laccase theo thời gian cho thấy, hoạt tính ở cơng thức xử lý đất ô nhiễm giảm nhanh theo thời gian, trong khi hoạt tính laccase ở mẫu đối chứng (khơng có đất ơ nhiễm, chỉ có cát sạch) giảm ít hơn gần 3 lần. Sau 27 ngày hoạt tính laccase ở mẫu xử lý giảm 97% so với 34% ở công thức đối chứng. Như vậy có thể khẳng định laccase thơ từ chủng FBV40 đã tham gia vào phân hủy 2,4-D,
2,4,5-T trong đất ô nhiễm tại sân bay Biên Hịa và laccase ở cơng thức chỉ có mặt cát sạch giảm khơng nhiều sau 27 ngày (Hình 3.41).
Hàm lượng (mg/kg) 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 (A) 14000 (B) 12000 (U /L ) 10000 Control 8000 tín h HCEF40 HCEF40 H oạ t 6000 Control 4000 2000 0
Ban dau 1ngày 5ngày 10ngày 15ngày 20 ngày 27ngày
2,4-D 2,4,5-T 2,4-DCP 2,4,5-TCP Thời gian
Hình 3.41. Hiệu suất phân hủy 2,4,5-T trong đất (A) và sự biến động
hoạt tính laccase thơ theo thời gian (B)
Theo Ron và đtg, khi sử dụng enzyme horseradish peroxidase (HRP) cùng với một lượng vừa đủ H2O2 đã phân hủy được tới 90% PCB9 với nồng độ ban đầu và 55% với PCB 52 trong môi trường dịch thể sau thời gian phản ứng là 220 phút. Quá trình loại clo được xác định là giai đoạn đầu của quá trình phân hủy sinh học PCB, các chất trao đổi được tạo ra là các chlorinated hydroxybiphenyls, benzoic acids, 1,10-biphenyl và các đồng loại chlorinated biphenyl với nồng độ cao. Phân hủy sinh học PCB 9 bằng loài nấm đảm trắng Trametes multicolor diễn ra trong 4 tuần và đã loại bỏ được hơn 80%. Các chất trao đổi được tạo ra là dichlorobenzenes, chlorophenols và alkylated benzenes, các chất này không giống với các chất được tạo ra khi sử dụng HRP, như vậy chứng tỏ các q trình phân hủy diễn ra khơng giống nhau [131]. Khả năng phân hủy 2,4-DBP, 2,4,6-TBP bởi laccase ở điều kiện bình thường đã chỉ ra rằng OH-PBDEs (Hydroxylated polybrominated diphenyl ethers) được tạo thành từ quá trình phân hủy 2,4-DBP và 2,4,6-TBP. Các chất 2′-OH-BDE68, 2,2′-diOH-BB80 và 1,3,8-TrBDD được chứng minh là các sản phẩm của quá trình phân hủy 2,4-DBP trong khi 2′-OH- BDE121 và 4′-OH-BDE121 là sản phẩm của sự phân hủy 2,4,6-TBP. Sự tạo thành các OH-PBDEs gần như là kết quả gắn kết các gốc bromophenoxy được tạo thành từ quá trình xúc tác oxy hóa của laccase đối với 2,4-DBP hoặc 2,4,6-TBP [76]. Nghiên cứu khác về việc sử dụng laccase và hệ các chất gắn kết trong phân hủy các thuốc diệt cỏ, đó là phân hủy isoproturon bằng laccase của loài Trametes versicolor và hệ chất gắn kết. Kết quả chỉ ra rằng laccase chỉ tham gia phân hủy một lượng rất nhỏ isoproturon do trong cấu trúc phân tử của thuốc diệt cỏ này có nhóm (NH-CO-N(CH3)2), đây là nhóm có lực hút electron rất
mạnh. Khi đánh giá khả năng phân hủy isoproturon với sự có mặt của chất gắn kết là HBT 0,5 mM, sau 24h đã cho thấy hiệu suất phân hủy lên tới 90%, trong khi nếu sử dụng 0,5mM ABTS thì hiệu suất phân hủy chỉ là 68,2%.
Hiện nay, chưa thấy có cơng trình nghiên cứu nào cơng bố về khả năng phân hủy chất diệt cỏ 2,4-D và 2,4,5-T trong đất ô nhiễm thực tế bằng laccase từ các chủng nấm nói chung và các chủng nấm thuộc Rigidoporus nói riêng. Chỉ có một số nghiên cứu đánh giá phân hủy đối với một số hợp chất hữu cơ khó phân hủy chứa clo ở quy mơ phịng thí nghiệm và phát hiện được các chất trao đổi thứ cấp để tìm ra cơ chế và con đường phân hủy. Kết quả nghiên cứu của đề tài do nghiên cứu sinh thực hiện sẽ là tiền đề để định hướng nghiên cứu công nghệ và tiếp tục nghiên cứu cơ bản để tìm hiểu sâu sắc hơn về vai trị và khả năng của laccase nói chung và laccase chủng Rigidoporus sp. FBV40 nói riêng trong phân hủy các hợp chất hữu cơ chứa clo.
3.3.3.2. Phân huỷ chất diệt cỏ/dioxin bởi nấm sinh tổng hợp laccase a) Phân huỷ 2,4,5-T có trong đất ơ nhiễm tại sân bay Biên Hịa
Kết quả nghiên cứu khả quan về khả năng phân hủy 2,4-D và 2,4,5-T có trong đất ơ nhiễm ở sân bay Biên Hịa bởi laccase thô từ chủng FBV40 cho thấy tiềm năng ứng dụng cao của laccase. Tuy nhiên, để triển khai ứng dụng chủng nấm (living basidiomycete fungal strain) trong xử lý chất diệt cỏ thì nghiên cứu khả năng phân hủy chất diệt cỏ bằng chủng nấm đảm FBV40 sinh tổng hợp laccase trên cũng đã được tiến hành. Trong nghiên cứu này chỉ tập trung đánh giá khả năng phân hủy 2,4,5-T bằng chủng FBV40. Kết quả được trình bày ở Bảng 3.13.
Bảng 3.13. Khả năng phân hủy 2,4,5-T trong đất ô nhiễm bởi chủng FBV40
Công thức Hàm lượng 2,4,5-T (mg/kg) Khả năng phân hủy (%)
Chủng FBV40 437,5 7,06
Đất ô nhiễm không có nấm 473,5
Chủng FBV40 có khả năng sinh trưởng và phát triển ở điều kiện đất ô nhiễm hỗn hợp chất diệt cỏ/dioxin thu thập tại sân bay Biên Hịa. Trong q trình sinh trưởng, chủng nấm vẫn có khả năng sinh tổng hợp laccase. Cụ thể, sau 3 ngày nuôi cấy hoạt tính laccse thơ ở mẫu thí nghiệm đạt cao nhất 5.534 U/L và sau đó hoạt tính giảm dần, trong khi ở mẫu đối chứng (chủng được nuôi trên môi trường TSH1 không bổ sung đất ô nhiễm hỗn hợp chất diệt cỏ/dioxin) sau 6 ngày ni cấy hoạt tính laccase thơ cao nhất đạt 66.125 U/L (Hình 3.42). Trong điều kiện thí nghiệm xử lý với hàm lượng 2,4,5-T cao tới 473,5 mg/kg
có trong đất, sau 8 ngày ni cấy ở điều kiện lắc 120 vịng/phút và nhiệt độ 30oC, chủng FBV40 đã phân hủy hơn 7% tương ứng với 36 mg/kg, nếu tính hiệu suất xử lý/ngày thì FBV40 đã xử lý được 45 µg 2,4,5-T/ngày. Kết quả này cho thấy khi sử dụng chủng nấm đảm FBV40 sống để xử lý chất diệt cỏ/dioxin thực sự có tiềm năng cao. Đây là kết quả gợi ý cũng như chứng minh rằng nấm đảm sinh tổng hợp laccase cao như FBV40 và nấm khác có tiềm năng lớn để xử lý chất diệt cỏ 2,4,5-T nói riêng và các chất đa vịng thơm chứa clo nói chung chắc chắn sẽ mang lại hiệu quả tại hiện trường ô nhiễm.