1000 U/L Laccase
3.1.1. Phân lập và lựa chọn chủng nấm đảm có hoạt tính laccase cao
Mục đích của nội dung sàng lọc các chủng nấm phải hướng tới mục địch là xác định các chủng nấm và enzyme do chúng tạo ra có khả năng hoạt động trong các điều kiện công nghiệp [15].
Việc phát hiện các laccase mới với các phổ cơ chất đặc biệt khác và nâng cao khả năng ổn định là quan trọng nhất để triển khai ứng dụng trong điều kiện công nghiệp. Nấm sinh laccase, MnP hoặc LiP được sàng lọc trên cả hai loại mơi trường rắn có chứa các chất chỉ thị khi oxy hóa sẽ tạo mầu nâu đỏ để dễ quan sát và nhận diện. Chúng có thể là laccase, MnP hay LiP và laccase được xác định bằng phương pháp được trình bày ở phần sau [111] hoặc trong điều kiện ni cấy lỏng xác định hoạt tính laccase bằng các phép đo các thơng số chuẩn [84].
Sau khi thu thập được 45 mẫu nấm từ gỗ mục, đất tại rừng Quốc gia Ba Vì và xã trồng chè Ba Trại thuộc huyện Ba Vì để tiến hành sàng lọc khả năng sinh tổng hợp laccase, hai mươi hai chủng nấm có hệ sợi phát triển tốt, lan rộng trên bề mặt mơi trường, hệ sợi nấm bơng xốp có màu trắng, mịn và tạo vịng nâu đỏ với cường độ khác nhau trên mơi trường có chứa chất chỉ thị guaiancol đã được phân lập sau 4 ngày ni cấy. Hoạt tính laccase in situ được xác định trước khi được phân lập. Kết quả thu được chứng tỏ ở giai đoạn thu mẫu các chủng này đã sinh tổng hợp các enzyme ngoại bào thuộc nhóm peroxidase (Mangan peroxidase-MnP và Lignin peroxidase- LiP) hoặc oxidoreductase (laccase). Các mẫu không xác định được sau khi ni cấy trên mơi trường đặc hiệu có chỉ thị guaiacol sẽ được tiếp tục khẳng định khả năng sinh tổng hợp 2 loại enzyme trên. Danh sách và một số đặc điểm sinh học của mẫu nấm được trình bày ở Bảng 3.1 và chi tiết hơn ở Bảng 1 Phụ lục. Kết quả cho thấy có khoảng 16 mẫu nấm thu thập được ở rừng Quốc gia Ba Vì sinh tổng hợp laccase. Ngay mẫu tươi (trước khi phân lập) đã có thể đo được hoạt tính enzyme in situ giao động trong khoảng từ 3 đến 150 U/L. Dựa vào kết quả đo hoạt tính laccase in situ và khả năng sinh trưởng nhanh, dễ nuôi cấy, chủng FBV40 đã
được lựa chọn để nghiên cứu phân loại, đặc tính enzyme, khả năng loại màu thuốc nhuộm và phân hủy chất diệt cỏ/dioxin.
Sử dụng phương pháp truyền thống và so sánh độ tương đồng giữa trình tự vùng ITS1-5,8S-ITS2 của FBV40 với các chủng đại diện trên GenBank, FBV40 đã được định danh.
Hình 3.1. Hỉnh ảnh sợi, bào tử dưới kính hiển vị điện tử và ảnh phân lập mặt trước, mặt sau
của chủng FBV40
Bảng 3.1. Đặc điểm mẫu nấm đã phân lập được
Laccase
TT Mẫu Đặc điểm tự nhiên Đặc điểm phân lập in-situ
(U/L) 1 A2 Quả thể màu đen, có viền Khuẩn lạc có hệ sợi màu trắng, tâm -
trắng, thân dày lõm, và khơng tạo vịng nâu đỏ Quả thể màu đen, có viền Khuẩn lạc có hệ sợi màu trắng,
2 A9 màu cam, thân mỏng xốp, tâm lồi, có màu đen, khơng tạo - vòng nâu đỏ
3 A14 Quả thể màu trắng, xốp và Khuẩn lạc có hệ sợi màu trắng, 20
mềm xốp, dày, tâm lồi, tạo vòng nâu đỏ
4 A17 Quả thể màu xanh xám, Khuẩn lạc có hệ sợi màu trắng, xốp, 76 xốp và mềm sợi mỏng, tâm lồi, tạo vòng nâu đỏ
5 A19 Quả thể màu trắng, xốp và Khuẩn lạc có hệ sợi màu trắng, 3
Laccase
TT Mẫu Đặc điểm tự nhiên Đặc điểm phân lập in-situ
(U/L) 6 A21 Quả thể màu vàng, to và Khuẩn lạc có hệ sợi màu trắng, 15
mềm. Mọc trên đất xốp, dày, tâm lõm, tạo vòng nâu đỏ
7 A22 Quả thể màu trắng, mềm, Khuẩn lạc có hệ sợi màu xám, xốp, - bóng ướt. Mọc trên thân cây tâm lồi, khơng tạo vịng nâu đỏ
8 A25 Quả thể màu trắng, bé. Mọc Khuẩn lạc có hệ sợi màu trắng, 11 trên thân cây măng xốp, tâm lồi, tạo vòng nâu đỏ
9 A27 Quả thể màu trắng, hình sợi. Khuẩn lạc có hệ sợi màu xám, - Mọc trên thân cây măng mỏng, dai, khơng tạo vịng nâu đỏ
Quả thể màu đen xám, viền Khuẩn lạc có hệ sợi màu trắng,
10 A31 màu trắng, có lỗ, cứng. răng cưa, xốp, lõm, tạo vòng nâu đỏ 5
Mọc trên thân cây
11 A32 Quả thể đen, dày, cứng. Khuẩn lạc có hệ sợi màu trắng, 3 Mọc trên thân cây xốp, dày, lồi, tạo vòng nâu đỏ
12 A36 Quả thể trắng, mỏng, mềm. Khuẩn lạc có hệ sợi màu trắng, 24 Mọc trên thân cây xốp, lồi, tạo vòng xám đen
13 A44 Quả thể màu đen, dày, Khuẩn lạc có hệ sợi màu trắng, 10 cứng. Mọc từ đất xốp, lồi, tạo vòng nâu đỏ
Quả thể màu cam, viền Khuẩn lạc có hệ sợi màu trắng,
14 A46 trắng, dày, mềm. Mọc trên xốp, lồi, tạo vòng nâu đỏ 35
cây
15 BT2 Khơng có quả thể, màu Khuẩn lạc có hệ sợi màu xám trắng, - xám, mềm. Mọc trên cây lõm, tạo vòng nâu đỏ
16 BT4 Quả thể trắng xám, xốp, có Khuẩn lạc có hệ sợi màu trắng, trịn 25 lỗ. Mọc trên cây mỏng, lồi, tạo vòng nâu đỏ
17 BT5 Quả thể màu trắng xám, Khuẩn lạc có hệ sợi màu trắng, trịn 25 xốp, có lỗ. Mọc trên cây mỏng, lồi, tạo vòng nâu đỏ
18 BT7 Quả thể màu trắng, tròn, Khuẩn lạc có hệ sợi màu xám trắng, - xốp, có lỗ. Mọc trên cây trịn dày, lồi, khơng tạo vòng nâu đỏ
Quảthểmàu vàng, Khuẩn lạc có hệ sợi màu trắng, trịn
19 BT8 trịn,viền trắng, xốp, có lỗ. mỏng, lồi, tạo vịng nâu đỏ 5
Mọc trên cây
Quả thể vàng xám, viền Khuẩn lạc có hệ sợi màu trắng, trịn
20 BT9 trắng, xốp, có lỗ. Mọc trên mỏng, lồi, tạo vịng nâu đỏ 23
cây
21 BT10 Khơng có quả thể, màu xám Khuẩn lạc có hệ sợi màu vàng, dày, 11 trắng, mềm. Mọc trên cây. lồi, tạo vịng nâu vàng
22 FBV40 Khơng có quả thể, phân lập Khuẩn lạc có hệ sợi màu trắng, dày, 150 từ đất lẫn gỗ mục. xốp, lồi, tạo vịng nâu đỏ
Chú thích: (-) khơng xác định được
Dựa vào các đặc điểm hình thái của nấm tự nhiên, khuẩn lạc trên đĩa thạch và hệ sợi nấm dưới kính hiển vi quang học cho thấy chúng có khuẩn ty phân nhánh, quấn chặt vào nhau tạo hình dáng giống rễ cây và có vách ngăn ngang. Bước đầu xác
định FBV40 là nấm đảm. Tuy nhiên để làm rõ thêm các kết quả phân loại truyền thống, việc xác định và so sánh sự tương đồng giữa trình tự vùng ITS1-5,8S-ITS2 của chủng này và các chủng đại diện trên GenBank đã được tiến hành và đã được đăng ký trình tự trên GenBank với mã số MG243365. Trên cơ sở đặc điểm mẫu, hình thái khuẩn lạc, bào tử và trình tự vùng ITS1-5,8S-ITS2 chủng nấm FBV40 được xét vào chi Rigidoporus và được định danh là Rigidoporus sp. FBV40. Từ vị trí của chủng FBV40 trên cây phát sinh chủng loại cho thấy chủng này gần gũi nhất với chi Rigidoporus cụ thể là tương đồng đến 99% với các chủng là R. Vinctus C1-9 được phân lập từ rặng san hô của vùng biển Phúc Kiến và R. Vinctus FRIM 142 được phân lập từ rừng nhiệt đới ở Malaysia (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Hiện có rất ít thơng tin về những chủng nấm trên, đặc biệt thông tin về đặc điểm hình thái cũng như khả năng sinh tổng hợp laccase của các chủng nấm trên.
Hình 3.2. Cây phát sinh chủng loại của chủng nấm FBV40