Dữ liệu thô sau quá trình giải trình tự gen sẽ được đưa lên phầm mềm tin sinh học Bio Edit v7.0. Tại đây 4 loại nucleotide là A, T, G, C sẽ được biểu diễn dưới các đỉnh (peak) khác nhau. Trình tự nucleotide của gen CYP11B1 sẽ được so sánh với trình tự chuẩn từ ngân hàng gen.
Cấu trúc 3D protein được phân tích trên 2 chương trình phần mềm spdbv và ViewerLite. Chương trình spdbv cho phép thay đổi đột biến từ amino acid này sang amino acid khác, biểu hiện các liên kết trong phân tử,.... Chương trình ViewerLite42 biểu diễn cấu trúc không gian 3D protein.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
PHẦN III: KẾT QUẢ 3.1. Tách DNA tổng số
Trong nghiên cứu này, DNA tổng số được tách từ máu toàn phần của bệnh nhân có biểu hiện của bệnh TSTTBS. Phương pháp tách DNA được tiến hành theo bộ KIT DNAamp Blood Mini của hãng QIAGEN. Hiện nay có nhiều phương pháp tách DNA được áp dụng rộng rãi như phương pháp tách DNA bằng kit, tách DNA sử dụng Perchlorate sodium, sử dụng acetate d'ammonium… Nguyên lý cơ bản của các phương pháp tách DNA từ máu đều bao gồm 4 bước cơ bản: phá vỡ hồng cầu, phá vỡ bạch cầu, loại bỏ protein, thu hồi DNA. Phương tách DNA máu bằng bộ kit là phương pháp tách nhanh, sản phẩm thu được có nồng độ cao, đồng đều và độ tinh sạch đảm bảo.
DNA sau khi tách sẽ được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose. Phương pháp này dựa vào đặc tính cấu trúc của acid nucleic là mang điện âm đồng đều trên khắp bề mặt của một điện trường nên sẽ di chuyển về cực dương của điện trường. Tính linh động và vận tốc di chuyển trong điện trường phụ thuộc vào khối lượng phân tử và nồng độ các chất cấu thành gel.
Hình 3.1: Điện di DNA tổng số mẫu bệnh phẩm. M: Marker DNA chuẩn 1 kb 1,2,3: DNA tổng số mẫu bệnh phẩm
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Sau khi điện di, bản gel được nhuộm trong dung dịch ethidium bromid. Thuốc nhuộm ethidium bromid (EtBr) là một thuốc nhuộm huỳnh quang có thể nhận biết cả hai loại DNA sợi đơn và sợi kép. Mặc dù vậy, ái lực liên kết với DNA sợi đơn tương đối thấp hơn so với DNA sợi kép. DNA nhuộm EtBr được nhận biết bằng tia cực tím vì thế dưới tác dụng của ánh sáng UV, băng vạch DNA trên bản gel sẽ được hiện hình rõ ràng.
Kết quả điện di cho thấy, sản phẩm DNA hiện sáng rõ, không bị đứt gãy, đã loại bỏ tạp chất và RNA. Sản phẩm DNA có thể dùng làm nguyên liệu cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.2. Xác định hàm lƣợng và độ tinh sạch của DNA bằng quang phổ kế
Nồng độ DNA được xác định dựa vào độ hấp phụ ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260 nm của các base. Giá trị mật độ quang ở bước sóng 260 nm của các mẫu đo cho phép xác định nồng độ acid nucleic trong mẫu dựa vào mối tương quang : Một đơn vị OD260nm tương ứng với nồng độ: 50 µg/ml cho một dung dịch DNA sợi đôi, 40 µg/ml cho một dung dịch DNA hay RNA sợi đơn.
Để kiểm tra độ tinh sạch của dung dịch, dung dịch DNA được đo thêm ở mật độ quang bước sóng 280 nm (A280 nm). Đây là bước sóng các protein có mức hấp thụ cao nhất. Một dung dịch DNA được xem là sạch khi tỷ số A260 nm/ A280 nm nằm trong khoảng 1,8 - 2.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Bảng 3.1: Kết quả đo quang phổ mẫu DNA tổng số.
Mẫu A260nm A280nm Nồng độ DNA mẫu
(ng/µl)
A260 nm/ A280 nm
01 1,820 0,951 91 1,914
02 1,723 0,905 86,15 1,903
03 1,803 0,967 90,15 1,864
Kết quả đo mật độ quang cho thấy, sản phẩm DNA sau khi tách có nồng độ và độ tinh sạch cao, đảm bảo chất lượng cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.3. Khuếch đại đoạn gen CYP11B1
Đoạn gen CYP11B1 có kích thước khoảng 7 kb, bao gồm 9 exon và 8 intron, vì thế, 3 cặp mồi đặc hiệu được thiết kế để khuếch đại được toàn bộ đoạn gen (Hình 3.1).
Hình 3.2. Sơ đồ nhân đoạn genCYP11B1. Chiều dài gen CYP11B1 khoảng 7 kb gồm 9 exon, được chia thành 3 đoạn gen A (2,5 kb), B (1,6 kb) và C (2,3kb) để nhân toàn bộ gen.
Vì gen CYP11B1 và CYP11B2 có độ tương đồng rất cao (90%), nên khi thiết kế các cặp mồi cần phải chú ý các điểm khác nhau của 2 đoạn gen này để tránh nhân nhầm gen CYP11B2.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Tất cả các thành phần và chu trình của phản ứng PCR được tính toán sao cho nồng độ gen thu được tối ưu nhất, tránh xuất hiện các đoạn băng phụ và các thành phần bị dư. Số chu kì trong một phản ứng PCR thường là 25 – 35, tùy thuộc vào lượng bản mẫu ban đầu. Số chu kì thường không vượt quá 40 vì lúc đó hiệu quả khuếch đại bị giảm do cạn kiệt các thành phần của phản ứng hoặc có thể xuất hiện các sản phẩm phụ, ức chế phản ứng. Trong nghiên cứu này, với lượng DNA khuôn mẫu đưa vào là 50 ng DNA tổng số, 30 chu kì PCR được thiết lập như đã nêu ở phần 2.2.4. Đối với cặp mồi đặc hiệu đã được thiết kế, nhiệt độ cho giai đoạn gắn mồi được tính toán theo nhiệt độ nóng chảy của từng đoạn mồi theo công thức:
Tm = 20C x (A + T) + 40C x (G +C) + 3,30C
A, T, G, C: số lượng các bazơ nitơ
Để tiết kiệm thời gian, nhiệt độ gắn mồi tối ưu được lựa chọn để khuếch đại cùng lúc 3 đoạn gen A, B, C là 600
C trong 1 phút.
Tính chính xác và hiệu suất của enzyme DNA polymerase phụ thuộc nhiều vào hệ buffer sử dụng. Một thành phần quan trọng trong hệ đệm là Mg++
. Thành phần này giúp tạo phức với dNTP, cần thiết để gắn dNTP vào enzyme, kích thích hoạt tính của polymerase. Nồng độ Mg++ cao làm các DNA không biến tính hoàn toàn, sản phẩm bị ít đi. Tuy nhiên nồng độ Mg++
ít lại làm xấu quá trình kéo dài chuỗi DNA mới. Với DNA polymerase của hãng Dream Taq, Mg++
đã đượng bổ sung vào dung dịch buffer với nồng độ tối ưu, phù hợp với DNA polymerase.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.3. Điện di sản phẩm nhân gen CYP11B1. M: Marker chuẩn 1 kb; 1: đoạn gen nhân bằng mồi A (2,5 kb); 2: đoạn gen nhân bằng mồi B (1,6 kb); 3: đoạn gen nhân bởi mồi C (2,3 kb).
Với điều kiện được tính toán tối ưu của chu trình PCR, sản phẩm DNA thu được sau khi điện di trên gel agarose có kích thước hoàn toàn phù hợp với tính toán lý thuyết (Hình 3.2).
Kết quả điện di cho thấy, sản phẩm DNA là băng đặc hiệu, không xuất hiện băng phụ, tuy nhiên vẫn còn còn mồi dư và dNTP ở cuối bản gel. Vì thế, để đảm bảo quá trình đọc trình tự được chính xác, sản phẩm DNA cần được tinh sạch để loại bỏ các thành phần phụ.
Đoạn gen được tinh sạch bằng bộ Kit Gen Jet™ Gel Extraction của hãng Fermentas bằng phương pháp thôi gel. Với phương pháp này, các thành phần không mong muốn như mồi dư và dNTP sẽ bị loại bỏ khi tiến hành cắt gel, chỉ thu lại phần gel chứa đoạn gen mong muốn.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.4. Điện di sản phẩm tinh sạch genCYP11B1. M: Marker chuẩn 1 kb; 1: đoạn gen nhân bằng mồi A (2,5 kb); 2: đoạn gen nhân bằng mồi B (1,6 kb); 3: đoạn gen nhân bởi mồi C (2,3 kb).
3.4. Phân tích ảnh hƣởng của đột biến trên gen CYP11B1 ở bệnh nhân 3.4.1. Bệnh nhân 01 3.4.1. Bệnh nhân 01
3.4.1.1. Xét nghiệm lâm sàng, hóa sinh
Lâm sàng: Khi nhập viện trẻ mệt, nặng 30 kg, nhịp tim 75 lần/phút, thở 20 lần/phút, huyết áp 100/80 mmHg, da xạm, liệt mềm tứ chi, không rối loạn cảm giác, không rối loạn cơ tròn, cơ lực bình thường, phản xạ gân xương bình thường, không liệt dây thần kinh sọ, không dấu hiệu thần kinh khu trú, không có cầu bàng quang. Biểu hiện bộ phận sinh dục ngoài bất thường, có kiểu hình của nam.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Bảng 3.2. Kết quả xét nghiệm hóa sinh bệnh nhân 01
Tên xét nghiệm Nồng độ ở bệnh nhân Nồng độ bình thƣờng
Ca2+ (mmol/L) 0,8 1,16 - 1,32
Na+ (mmol/L) 137 135 – 155
K+ (mmol/L) 2,0 3,5 - 5,5
Cortisol lúc 8h (mmol/L) 340,9 83 – 580
ACTH (pmol/L) 10,5 Dưới 18
Testosterone (nmol/L) 9 0,35 - 2,60
17-OHP (ng/L) 0,87 Dưới 0,2
Từ những kết quả bảng 3.2, nhận định ban đầu được đưa ra là bệnh nhân mắc CAH, suy giảm một phần 11β-hydroxylase khi lượng muối trong cơ thể giảm cùng với hai loại steroid hormone đại diện cho hormone nam giới là testostrone và 17-OHP tăng cao trong khi huyết áp và hàm lượng cortisol vẫn đạt mức bình thường.
3.4.1.2. Phân tích trình tự phát hiện đột biến
Sản phẩm DNA tinh sạch được đọc trình tự bằng các cặp mồi đã nêu ở bảng 2.2. Trong quá trình này, bên cạnh việc giải trình tự các vùng exon, để chắc chắn không có đột biến xảy ra tại những vùng không mã hóa thông tin, những vùng biên bao quanh các exon cũng đã được đọc trình tự. Kết quả giải trình tự gen được đưa lên phần mềm tin học BioEdit. Trên phần mềm này, trình tự gen CYP11B1 của người bệnh được so sánh với trình tự gen CYP11B1 chuẩn trên ngân hàng gen người.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.5. Phân tích di truyền đột biến ở bệnh nhân 01. A, Vị trí các đột biến ở bệnh nhân trên gen CYP11B1. B, Sơ đồ phả hệ di truyền bệnh từ bố mẹ. Ia, Ib: bố và mẹ; hình vuông: nam giới, hình tròn: nữ giới. II: con. C, Kết quả trình tự trình tự gen.
Kết quả phân tích trình tự phát hiện 2 đột biến dị hợp tử trên exon 3 ở gen
CYP11B1 của người bệnh (Hình 3.5). Một đột biến xảy ra tại vị trí 441 trên cDNA
CYP11B1, A bị thay thế thành T, làm biến đổi bộ ba mã hóa GAA thành GAT. Sự thay thế nucleotide trên cDNA dẫn đến sự thay thế acid amin trên chuỗi protein ở vị trí codon 147, Lutamic bị thay thế thành Aspartic. Đột biến thứ 2 phát hiện trên exon này là đột biến tại vị trí c.456, C bị thay thế bởi G, làm biến đổi bộ ba mã hóa acid amin AAC thành AAC. Sự biến đổi của bộ ba mã hóa này cũng dẫn đến sự thay đổi của acid amin trên chuối protein, Asparagine bị thay thế bởi Lysine.
3.4.1.3. Biểu hiện của đột biến trong tế bào động vật
Các protein đột biến và protein hoang dại được biểu hiện cùng với plasmid pBAdx4 trong tế bào COS-1 để phân tích và so sánh đặc tính của các thể đột biến. Sự
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
biểu hiện đồng thời với pbAdx đã được chứng minh là có ích trong việc tăng hoạt tính của CYP11B1 cũng như CYP11B2 trong hệ biểu hiện tế bào động vật COS-1 [20].
Sự biểu hiện của CYP11B1 hoang dại và đột biến trong tế bào động vật COS-1 được xác định lại bằng lai Western (Hình 3.6). Sự biểu hiện của 11β-hydroxylase của đột biến (p.E147D và p.N152K) và hoang dại đã được phát hiện với một băng có kích thước khoảng 48,6 kDa. Điều này chứng tỏ rằng 2 đột biến và hoang dại đã được biểu hiện trong tế bào động vật và không ảnh hưởng tới sự dịch mã của 11β-hydroxylase.
Hình 3.6. Phân tích lai Western về sự biểu hiện của CYP11B1 ở bệnh nhân 01trong tế bào COS-1. Các tế bào COS-1 sau biến nạp được nuôi trong môi trường có cơ chất 11-deoxycortisol (RSS). Protein của CYP11B1-WT, p.E147D, p.N152K và Mock (vector pSVL không mang cDNA của CYP11B1) được phân tách trên gel SDS- PAGE. Sau khi chuyển qua màng nitrocellulose, các protein được phát hiện bằng kháng thể thỏ kháng CYP11B người và được phát hiện trên phim bằng kit ECL.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.7. Hoạt tính của 11β-hydroxylase ở tế bào động vật COS-1. Sau khi biến nạp 5 µM 11-deoxycortisol (RSS) và 0,6 µCi [3
H]-RSS được thêm vào môi trường nuôi tế bào. Các thành phần của steorid được chuyển hóa từ cơ chất RSS tới cortisol (F), thí nghiệm được tiến hành 3 lần lặp lại độc lập. Sự chuyển hóa RSS tới F của thể hoang dại được tính là 100%. Hoạt tính của đột biến được biểu hiện được so sánh với thể hoang dại.
Sau khi sự biểu hiện protein được xác định bằng lai Western và tế bào COS-1 được ủ với cơ chất 11β-deoxycortisol để kiểm tra hoạt tính enzyme của protein biểu hiện. Sau 72 h nuôi cấy, các steroid được tách chiết và phân tách trên sắc ký lớp mỏng. Hoạt tính của của 2 đột biến p.E147D, và p.N152K được so sánh với thể hoang dại (Hình 3.7). Đột biến p.E147D giảm hoạt tính tới 52% so với thể hoang dại. Đột biến p.N152K giảm khoảng 64% hoạt tính so với thể hoang dại.
3.4.2. Bệnh nhân 02
3.4.2.1. Xét nghiệm lâm sàng, hóa sinh
Xét nghiệm lâm sàng: Ngay sau đẻ đã thấy bộ phận sinh dục ngoài bất thường, khám lúc 3 tuổi (14/11/1998). Biểu hiện: ngoại hình nữ, cơ bắp phát triển, cao 98 cm, nặng 15 kg, âm vật như dương vật dài 2 cm, Prader III. Huyết áp 120/80 mmHg; Các
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
xét nghiệm: Nhiễm sắc thể 46,XX; SRY (-); siêu âm không có u thượng thận; Chụp X quang: tuổi xương tương đương trẻ 7 tuổi (tuổi thực 3 tuổi) và tuổi xương tương đương trẻ 13 tuổi khi tuổi thực là 8 tuổi.
Xét nghiệm hóa sinh (Bảng 3.3)
Bảng 3.3. Kết quả xét nghiệm hóa sinh bệnh nhân 02
Tên xét nghiệm Nồng độ ở bệnh nhân Nồng độ mức bình thƣờng
Ca2+ (mmol/L) 0,8 1,16 - 1,32
Na+ (mmol/L) 137 135 – 155
K+ (mmol/L) 3,8 3,5 - 5,5
Cortisol lúc 8h (mmol/L) 478 83 – 580
ACTH (pmol/L) 10,5 Dưới 18
Testosterone (nmol/L) 20,9 0,35 - 2,60
17-OHP (ng/L) 0,57 Dưới 0,2
17CS niệu µmol/24 giờ 20,6 Dưới 7
17-OHCS µmol/24 giờ 15,1 2,8 – 15,5
3.4.2.2. Phân tích trình tự phát hiện đột biến
Kết quả phân tích và so sánh trình tự gen CYP11B1 của bệnh nhân 02 với gen
CYP11B1 của người bình thường phát hiện một đột biến mới ở exon 1. Đột biến thay thế nucleotide G thành A tại vị trí 152 trên chuỗi cDNA. Đột biến dẫn đến sự thay đổi
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
bộ ba AGG mã hóa acid amin Arginine thành bộ ba AAG mã hóa acid amin Lysine. Vì thế đột biến p.R51K xảy ra tại vị trí codon 51 trên chuỗi protein CYP11B1 (Hình 3.8).
Hình 3.8. Phân tích di truyền đột biến ở bệnh nhân 02. A, Vị trí các đột biến ở bệnh nhân trên gen CYP11B1. B, Sơ đồ phả hệ di truyền bệnh từ bố mẹ. Ia, Ib: bố và mẹ; hình vuông: nam giới, hình tròn: nữ giới. II: con. C, Kết quả trình tự trình tự gen.
3.4.2.3. Biểu hiện của đột biến trong tế bào động vật
Vấn đề đặt ra là liệu đột biến này có ảnh hưởng thế nào đến biểu hiện lâm sàng hóa sinh của người bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh? Để trả lời câu hỏi này, đột biến p.R51K được biểu hiện trong tế bào động vật COS-1, so sánh với kiểu gen bình thường. Tế bào COS-1 có nguồn gốc từ tế bào vỏ thượng thận của khỉ được nuôi ở tủ ấm CO2 (370C và 6% CO2) trên môi trường DMEM.
Bằng phương pháp tạo đột biến điểm trực tiếp và biểu hiện thể đột biến trong tế bào động vật theo nghiên cứu của Nguyễn Huy Hoàng và cộng sự năm 2008 [20], sản phẩm steroid được so sánh và phân tích khá chính xác (Hình 3.9).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.9. Phân tích Western blot về sự biểu hiện của CYP11B1 ở bệnh nhân 02 trong tế bào COS-1. Protein của CYP11B1-WT, p.R51K, và Mock (vector pSVL không mang cDNA của CYP11B1) được phân tách trên gel SDS/PAGE. Sau khi chuyển qua màng nitrocellulose, các protein được phát hiện bằng kháng thể thỏ kháng CYP11B người và được phát hiện trên phim bằng kit ECL.
Kết quả cho thấy sự biểu hiện của 11β-hydroxylase của đột biến p.R51K và