Nguyên tắc của PCR là sử dụng DNA polymerase chịu nhiệt để tổng hợp trong ống nghiệm các DNA mới, từ mạch khuôn trong môi trường dư thừa dNTP và các cặp mồi đặc hiệu. Các đoạn DNA mới hình thành lại được sử dụng làm khuôn để tổng hợp cho các chu kỳ tiếp theo. Như vậy số lượng bản sao sẽ tăng gấp 2 sau mỗi chu kỳ và sau n chu kỳ, tính theo lý thuyết số lượng bản sao là 2n
. Kỹ thuật PCR yêu cầu các thành phần sau: - DNA khuôn mẫu.
- Mồi đặc hiệu chiều dài 15 - 30 nucleotide.
- Bốn loại deoxyribonucleotide triphosphate (viết chung là dNTP). - Taq DNA polymerase chịu nhiệt.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Toàn bộ gen CYP11B1 bao gồm tất cả exon / intron được nhân lên bằng 3 cặp mồi riêng biệt (Bảng 2.2). Phản ứng PCR được tiến hành với tổng thể tích là 50 µl bao gồm 1X Dream Tag Buffer, 10 mmol/L dNTP, 10 pmol mỗi mồi, 200 ng DNA tổng số và 2 U Dream Tag polymerase. Chu trình nhiệt nhân gen CYP11B1 bắt đầu bằng tiền biến tính 95°C/ 3 phút; tiếp theo là 30 chu kì gắn mồi và kéo dài bao gồm biến tính 95°C/ 1 phút, gắn mồi ở 60°C/ 1 phút và kéo dài chuỗi ở 72°C/ 3 phút; bước cuối cùng là 72°C/ 10 phút.
2.2.5
Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng phương pháp thôi gel sau khi tiến hành điện di các mẫu PCR lượng lớn. Phần gel chứa đoạn gen mong muốn được cắt và thu vào ống effendorf 1,5 ml đã khử trùng. Đoạn gen được tinh sạch bằng bộ Kit Gen Jet™ Gel Extraction của hãng Fermentas.