2.2.1. Tách chiết DNA tổng số
DNA tổng số được tách chiết từ máu bệnh phẩm bằng bộ KIT DNAamp Blood Mini của hãng QIAGEN. Qui trình được tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Sản phẩm DNA tổng số được tiến hành điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% và đo quang phổ để xác định nồng độ cùng với độ tinh sạch.
2.2.2. Điện di DNA trên gel agarose
Mẫu DNA được điện di trên gel agarose 0,8 % trong dung dịch TAE 1X. Chạy điện di ở hiệu điện thế 100V trong khoảng 30 phút. DNA di chuyển từ cực âm đến cực dương
Nhuộm bằng EtBr: bản gel được lấy ra khỏi khuôn và ngâm vào dung dịch EtBr nồng độ 2 µg/ml trong thời gian khoảng 10 phút trên máy lắc nhẹ. Bản gel được tráng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
qua nước rồi quan sát và chụp ảnh dưới ánh sáng tia tử ngoại của máy soi chụp gel (Bio – Rad).
2.2.3. Đo quang phổ DNA
Dung dịch chứa DNA tổng số được đo quang phổ ở bước sóng 260 nm. Giá trị mật độ quang ở bước sóng 260 nm (OD260 nm – Optical Density) của các mẫu DNA cho phép xác định nồng độ DNA trong dung dịch. Mỗi đơn vị OD ở bước sóng 260 nm kýhiệu là A260 nm.
Khi đó, công thức chung tính nồng độ DNA tổng số: C DNA (ng/µl)= A260 nm × 50 × độ pha loãng
Trong đó:
CDNA:nồng độ DNA tổng số (ng/µl)
A260 nm: mật độ quang ở bước sóng 260 nm
2.2.4. Nhân gen bằng kĩ thuật PCR
Nguyên tắc của PCR là sử dụng DNA polymerase chịu nhiệt để tổng hợp trong ống nghiệm các DNA mới, từ mạch khuôn trong môi trường dư thừa dNTP và các cặp mồi đặc hiệu. Các đoạn DNA mới hình thành lại được sử dụng làm khuôn để tổng hợp cho các chu kỳ tiếp theo. Như vậy số lượng bản sao sẽ tăng gấp 2 sau mỗi chu kỳ và sau n chu kỳ, tính theo lý thuyết số lượng bản sao là 2n
. Kỹ thuật PCR yêu cầu các thành phần sau: - DNA khuôn mẫu.
- Mồi đặc hiệu chiều dài 15 - 30 nucleotide.
- Bốn loại deoxyribonucleotide triphosphate (viết chung là dNTP). - Taq DNA polymerase chịu nhiệt.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Toàn bộ gen CYP11B1 bao gồm tất cả exon / intron được nhân lên bằng 3 cặp mồi riêng biệt (Bảng 2.2). Phản ứng PCR được tiến hành với tổng thể tích là 50 µl bao gồm 1X Dream Tag Buffer, 10 mmol/L dNTP, 10 pmol mỗi mồi, 200 ng DNA tổng số và 2 U Dream Tag polymerase. Chu trình nhiệt nhân gen CYP11B1 bắt đầu bằng tiền biến tính 95°C/ 3 phút; tiếp theo là 30 chu kì gắn mồi và kéo dài bao gồm biến tính 95°C/ 1 phút, gắn mồi ở 60°C/ 1 phút và kéo dài chuỗi ở 72°C/ 3 phút; bước cuối cùng là 72°C/ 10 phút.
2.2.5
Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng phương pháp thôi gel sau khi tiến hành điện di các mẫu PCR lượng lớn. Phần gel chứa đoạn gen mong muốn được cắt và thu vào ống effendorf 1,5 ml đã khử trùng. Đoạn gen được tinh sạch bằng bộ Kit Gen Jet™ Gel Extraction của hãng Fermentas.
2.2.6. Giải trình tự gen tự động trên máy
Trình tự gen được xác định trên máy xác định trình tự tự động ABI PRISM 3100 Gentic Analyzer kết hợp với sử dụng bộ kit BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing.
Thành phần hỗn hợp sử dụng trong xác định trình tự DNA bao gồm cả dNTPs và ddNTPs trong đó ddNTPs là 4 loại nucleotide được đánh dấu bằng các chất phát huỳnh quang khác nhau.
Mồi sử dụng để giải trình tự trong bảng 2.2. Phản ứng gắn các nucleotide đánh dấu vào sợi DNA tổng hợp trên sợi khuôn được tiến hành trên máy PCR. Quá trình tổng hợp kéo dài chuỗi sẽ không tiếp tục diễn ra khi ddNTP được lắp vào, kết quả là tạo ra một bộ các đoạn có chiều dài hơn kém nhau một nucleotide.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
2.2.7. Tạo đột biến điểm trực tiếp (Site-directed mutagensis)
Đột biến điểm được tạo ra trên vector pSVLh11B1 bằng việc sử dụng kit Quik- Change Site-Directed Mutagensis (Stratagen Ltd., Cambridge, UK). Trình tự biểu hiện CYP11B1 trên cấu trúc vector pSVLh11B1 trong tế bào động vật được xem như đối chứng (wild-type). Các cặp mồi đáp ứng với sự thay đổi của amino acid trên bảng 2.2. Chu trình nhiệt tạo đột biến điểm được miêu tả theo phương pháp của TS. Nguyễn Huy Hoàng và cộng sự năm 2008 [20]. Các đột biến điểm được kiểm tra lại bằng đọc trình tự gen (MWG Eurofins, Ebersberg, Germany).
2.2.8. Biểu hiện trong tế bào COS-1 và phân tích hoạt tính enzyme
Dòng tế bào COS-1 được nuôi cấy trong môi trường DMEM có bổ sung 5% huyết thanh bò (fetal bovine serum), 0,1 mg/ml streptomycin, 100 U/ml penicillin, 1 mM pyruvate và 4 mM L-glutamine. Các tế bào được nuôi cấy tới mật độ khoảng 2 × 105 / đĩa sau 18-24 h, sau đó tế bào này được biến nạp với 1 µg vector pSVLh11B1 và 1 µg vector biểu hiện bovine adrenodoxin (pbAdx) bằng việc sử dụng kit Effectene Transfection Reagent (Qiagen). Sau 6 h biến nạp, các tế bào được ủ nuôi tiếp ở 37 ºC, 72 h trong 4 ml môi trường có bổ sung 0,6 µCi [3H]- 11-deoxycortisol. Steroid được tách chiết 2 lần từ dịch nổi của tế bào (800 µl) với chloroform và các sản phẩm steroid được phân tích bằng sắc ký lớp mỏng theo TS. Nguyễn Huy Hoàng và cộng sự năm 2008 [20].
Phân tích Western bot để chứng minh sự biểu hiện của wild-type và đột biến của 11-hydroxylase trong tế bào động vật. Protein được tách chiết từ tế bào COS-1 (200 µg) được đưa lên gel 10% SDS-PAGE và sau đó được chuyển sang màng nitrocellulose. CYP11B1 được phát hiện với kháng thể thỏ kháng CYP11B người (Charles River Laboratories, Germany) và phát hiện hình ảnh bằng bộ kit ECL (Amersham Biosciences, UK).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
2.2.9. Phân tích trình tự gen trên phần mềm tin học
Dữ liệu thô sau quá trình giải trình tự gen sẽ được đưa lên phầm mềm tin sinh học Bio Edit v7.0. Tại đây 4 loại nucleotide là A, T, G, C sẽ được biểu diễn dưới các đỉnh (peak) khác nhau. Trình tự nucleotide của gen CYP11B1 sẽ được so sánh với trình tự chuẩn từ ngân hàng gen.
Cấu trúc 3D protein được phân tích trên 2 chương trình phần mềm spdbv và ViewerLite. Chương trình spdbv cho phép thay đổi đột biến từ amino acid này sang amino acid khác, biểu hiện các liên kết trong phân tử,.... Chương trình ViewerLite42 biểu diễn cấu trúc không gian 3D protein.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
PHẦN III: KẾT QUẢ 3.1. Tách DNA tổng số
Trong nghiên cứu này, DNA tổng số được tách từ máu toàn phần của bệnh nhân có biểu hiện của bệnh TSTTBS. Phương pháp tách DNA được tiến hành theo bộ KIT DNAamp Blood Mini của hãng QIAGEN. Hiện nay có nhiều phương pháp tách DNA được áp dụng rộng rãi như phương pháp tách DNA bằng kit, tách DNA sử dụng Perchlorate sodium, sử dụng acetate d'ammonium… Nguyên lý cơ bản của các phương pháp tách DNA từ máu đều bao gồm 4 bước cơ bản: phá vỡ hồng cầu, phá vỡ bạch cầu, loại bỏ protein, thu hồi DNA. Phương tách DNA máu bằng bộ kit là phương pháp tách nhanh, sản phẩm thu được có nồng độ cao, đồng đều và độ tinh sạch đảm bảo.
DNA sau khi tách sẽ được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose. Phương pháp này dựa vào đặc tính cấu trúc của acid nucleic là mang điện âm đồng đều trên khắp bề mặt của một điện trường nên sẽ di chuyển về cực dương của điện trường. Tính linh động và vận tốc di chuyển trong điện trường phụ thuộc vào khối lượng phân tử và nồng độ các chất cấu thành gel.
Hình 3.1: Điện di DNA tổng số mẫu bệnh phẩm. M: Marker DNA chuẩn 1 kb 1,2,3: DNA tổng số mẫu bệnh phẩm
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Sau khi điện di, bản gel được nhuộm trong dung dịch ethidium bromid. Thuốc nhuộm ethidium bromid (EtBr) là một thuốc nhuộm huỳnh quang có thể nhận biết cả hai loại DNA sợi đơn và sợi kép. Mặc dù vậy, ái lực liên kết với DNA sợi đơn tương đối thấp hơn so với DNA sợi kép. DNA nhuộm EtBr được nhận biết bằng tia cực tím vì thế dưới tác dụng của ánh sáng UV, băng vạch DNA trên bản gel sẽ được hiện hình rõ ràng.
Kết quả điện di cho thấy, sản phẩm DNA hiện sáng rõ, không bị đứt gãy, đã loại bỏ tạp chất và RNA. Sản phẩm DNA có thể dùng làm nguyên liệu cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.2. Xác định hàm lƣợng và độ tinh sạch của DNA bằng quang phổ kế
Nồng độ DNA được xác định dựa vào độ hấp phụ ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260 nm của các base. Giá trị mật độ quang ở bước sóng 260 nm của các mẫu đo cho phép xác định nồng độ acid nucleic trong mẫu dựa vào mối tương quang : Một đơn vị OD260nm tương ứng với nồng độ: 50 µg/ml cho một dung dịch DNA sợi đôi, 40 µg/ml cho một dung dịch DNA hay RNA sợi đơn.
Để kiểm tra độ tinh sạch của dung dịch, dung dịch DNA được đo thêm ở mật độ quang bước sóng 280 nm (A280 nm). Đây là bước sóng các protein có mức hấp thụ cao nhất. Một dung dịch DNA được xem là sạch khi tỷ số A260 nm/ A280 nm nằm trong khoảng 1,8 - 2.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Bảng 3.1: Kết quả đo quang phổ mẫu DNA tổng số.
Mẫu A260nm A280nm Nồng độ DNA mẫu
(ng/µl)
A260 nm/ A280 nm
01 1,820 0,951 91 1,914
02 1,723 0,905 86,15 1,903
03 1,803 0,967 90,15 1,864
Kết quả đo mật độ quang cho thấy, sản phẩm DNA sau khi tách có nồng độ và độ tinh sạch cao, đảm bảo chất lượng cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.3. Khuếch đại đoạn gen CYP11B1
Đoạn gen CYP11B1 có kích thước khoảng 7 kb, bao gồm 9 exon và 8 intron, vì thế, 3 cặp mồi đặc hiệu được thiết kế để khuếch đại được toàn bộ đoạn gen (Hình 3.1).
Hình 3.2. Sơ đồ nhân đoạn genCYP11B1. Chiều dài gen CYP11B1 khoảng 7 kb gồm 9 exon, được chia thành 3 đoạn gen A (2,5 kb), B (1,6 kb) và C (2,3kb) để nhân toàn bộ gen.
Vì gen CYP11B1 và CYP11B2 có độ tương đồng rất cao (90%), nên khi thiết kế các cặp mồi cần phải chú ý các điểm khác nhau của 2 đoạn gen này để tránh nhân nhầm gen CYP11B2.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Tất cả các thành phần và chu trình của phản ứng PCR được tính toán sao cho nồng độ gen thu được tối ưu nhất, tránh xuất hiện các đoạn băng phụ và các thành phần bị dư. Số chu kì trong một phản ứng PCR thường là 25 – 35, tùy thuộc vào lượng bản mẫu ban đầu. Số chu kì thường không vượt quá 40 vì lúc đó hiệu quả khuếch đại bị giảm do cạn kiệt các thành phần của phản ứng hoặc có thể xuất hiện các sản phẩm phụ, ức chế phản ứng. Trong nghiên cứu này, với lượng DNA khuôn mẫu đưa vào là 50 ng DNA tổng số, 30 chu kì PCR được thiết lập như đã nêu ở phần 2.2.4. Đối với cặp mồi đặc hiệu đã được thiết kế, nhiệt độ cho giai đoạn gắn mồi được tính toán theo nhiệt độ nóng chảy của từng đoạn mồi theo công thức:
Tm = 20C x (A + T) + 40C x (G +C) + 3,30C
A, T, G, C: số lượng các bazơ nitơ
Để tiết kiệm thời gian, nhiệt độ gắn mồi tối ưu được lựa chọn để khuếch đại cùng lúc 3 đoạn gen A, B, C là 600
C trong 1 phút.
Tính chính xác và hiệu suất của enzyme DNA polymerase phụ thuộc nhiều vào hệ buffer sử dụng. Một thành phần quan trọng trong hệ đệm là Mg++
. Thành phần này giúp tạo phức với dNTP, cần thiết để gắn dNTP vào enzyme, kích thích hoạt tính của polymerase. Nồng độ Mg++ cao làm các DNA không biến tính hoàn toàn, sản phẩm bị ít đi. Tuy nhiên nồng độ Mg++
ít lại làm xấu quá trình kéo dài chuỗi DNA mới. Với DNA polymerase của hãng Dream Taq, Mg++
đã đượng bổ sung vào dung dịch buffer với nồng độ tối ưu, phù hợp với DNA polymerase.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.3. Điện di sản phẩm nhân gen CYP11B1. M: Marker chuẩn 1 kb; 1: đoạn gen nhân bằng mồi A (2,5 kb); 2: đoạn gen nhân bằng mồi B (1,6 kb); 3: đoạn gen nhân bởi mồi C (2,3 kb).
Với điều kiện được tính toán tối ưu của chu trình PCR, sản phẩm DNA thu được sau khi điện di trên gel agarose có kích thước hoàn toàn phù hợp với tính toán lý thuyết (Hình 3.2).
Kết quả điện di cho thấy, sản phẩm DNA là băng đặc hiệu, không xuất hiện băng phụ, tuy nhiên vẫn còn còn mồi dư và dNTP ở cuối bản gel. Vì thế, để đảm bảo quá trình đọc trình tự được chính xác, sản phẩm DNA cần được tinh sạch để loại bỏ các thành phần phụ.
Đoạn gen được tinh sạch bằng bộ Kit Gen Jet™ Gel Extraction của hãng Fermentas bằng phương pháp thôi gel. Với phương pháp này, các thành phần không mong muốn như mồi dư và dNTP sẽ bị loại bỏ khi tiến hành cắt gel, chỉ thu lại phần gel chứa đoạn gen mong muốn.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.4. Điện di sản phẩm tinh sạch genCYP11B1. M: Marker chuẩn 1 kb; 1: đoạn gen nhân bằng mồi A (2,5 kb); 2: đoạn gen nhân bằng mồi B (1,6 kb); 3: đoạn gen nhân bởi mồi C (2,3 kb).
3.4. Phân tích ảnh hƣởng của đột biến trên gen CYP11B1 ở bệnh nhân 3.4.1. Bệnh nhân 01 3.4.1. Bệnh nhân 01
3.4.1.1. Xét nghiệm lâm sàng, hóa sinh
Lâm sàng: Khi nhập viện trẻ mệt, nặng 30 kg, nhịp tim 75 lần/phút, thở 20 lần/phút, huyết áp 100/80 mmHg, da xạm, liệt mềm tứ chi, không rối loạn cảm giác, không rối loạn cơ tròn, cơ lực bình thường, phản xạ gân xương bình thường, không liệt dây thần kinh sọ, không dấu hiệu thần kinh khu trú, không có cầu bàng quang. Biểu hiện bộ phận sinh dục ngoài bất thường, có kiểu hình của nam.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Bảng 3.2. Kết quả xét nghiệm hóa sinh bệnh nhân 01
Tên xét nghiệm Nồng độ ở bệnh nhân Nồng độ bình thƣờng
Ca2+ (mmol/L) 0,8 1,16 - 1,32
Na+ (mmol/L) 137 135 – 155
K+ (mmol/L) 2,0 3,5 - 5,5
Cortisol lúc 8h (mmol/L) 340,9 83 – 580
ACTH (pmol/L) 10,5 Dưới 18
Testosterone (nmol/L) 9 0,35 - 2,60
17-OHP (ng/L) 0,87 Dưới 0,2
Từ những kết quả bảng 3.2, nhận định ban đầu được đưa ra là bệnh nhân mắc CAH, suy giảm một phần 11β-hydroxylase khi lượng muối trong cơ thể giảm cùng với hai loại steroid hormone đại diện cho hormone nam giới là testostrone và 17-OHP tăng cao trong khi huyết áp và hàm lượng cortisol vẫn đạt mức bình thường.
3.4.1.2. Phân tích trình tự phát hiện đột biến
Sản phẩm DNA tinh sạch được đọc trình tự bằng các cặp mồi đã nêu ở bảng 2.2. Trong quá trình này, bên cạnh việc giải trình tự các vùng exon, để chắc chắn không có đột biến xảy ra tại những vùng không mã hóa thông tin, những vùng biên bao quanh các exon cũng đã được đọc trình tự. Kết quả giải trình tự gen được đưa lên phần mềm tin học BioEdit. Trên phần mềm này, trình tự gen CYP11B1 của người bệnh được so sánh với trình tự gen CYP11B1 chuẩn trên ngân hàng gen người.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.5. Phân tích di truyền đột biến ở bệnh nhân 01. A, Vị trí các đột biến ở bệnh nhân trên gen CYP11B1. B, Sơ đồ phả hệ di truyền bệnh từ bố mẹ. Ia, Ib: bố và mẹ; hình vuông: nam giới, hình tròn: nữ giới. II: con. C, Kết quả trình tự trình tự gen.
Kết quả phân tích trình tự phát hiện 2 đột biến dị hợp tử trên exon 3 ở gen
CYP11B1 của người bệnh (Hình 3.5). Một đột biến xảy ra tại vị trí 441 trên cDNA
CYP11B1, A bị thay thế thành T, làm biến đổi bộ ba mã hóa GAA thành GAT. Sự thay thế nucleotide trên cDNA dẫn đến sự thay thế acid amin trên chuỗi protein ở vị trí codon 147, Lutamic bị thay thế thành Aspartic. Đột biến thứ 2 phát hiện trên exon này