3.4.2.1. Xét nghiệm lâm sàng, hóa sinh
Xét nghiệm lâm sàng: Ngay sau đẻ đã thấy bộ phận sinh dục ngoài bất thường, khám lúc 3 tuổi (14/11/1998). Biểu hiện: ngoại hình nữ, cơ bắp phát triển, cao 98 cm, nặng 15 kg, âm vật như dương vật dài 2 cm, Prader III. Huyết áp 120/80 mmHg; Các
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
xét nghiệm: Nhiễm sắc thể 46,XX; SRY (-); siêu âm không có u thượng thận; Chụp X quang: tuổi xương tương đương trẻ 7 tuổi (tuổi thực 3 tuổi) và tuổi xương tương đương trẻ 13 tuổi khi tuổi thực là 8 tuổi.
Xét nghiệm hóa sinh (Bảng 3.3)
Bảng 3.3. Kết quả xét nghiệm hóa sinh bệnh nhân 02
Tên xét nghiệm Nồng độ ở bệnh nhân Nồng độ mức bình thƣờng
Ca2+ (mmol/L) 0,8 1,16 - 1,32
Na+ (mmol/L) 137 135 – 155
K+ (mmol/L) 3,8 3,5 - 5,5
Cortisol lúc 8h (mmol/L) 478 83 – 580
ACTH (pmol/L) 10,5 Dưới 18
Testosterone (nmol/L) 20,9 0,35 - 2,60
17-OHP (ng/L) 0,57 Dưới 0,2
17CS niệu µmol/24 giờ 20,6 Dưới 7
17-OHCS µmol/24 giờ 15,1 2,8 – 15,5
3.4.2.2. Phân tích trình tự phát hiện đột biến
Kết quả phân tích và so sánh trình tự gen CYP11B1 của bệnh nhân 02 với gen
CYP11B1 của người bình thường phát hiện một đột biến mới ở exon 1. Đột biến thay thế nucleotide G thành A tại vị trí 152 trên chuỗi cDNA. Đột biến dẫn đến sự thay đổi
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
bộ ba AGG mã hóa acid amin Arginine thành bộ ba AAG mã hóa acid amin Lysine. Vì thế đột biến p.R51K xảy ra tại vị trí codon 51 trên chuỗi protein CYP11B1 (Hình 3.8).
Hình 3.8. Phân tích di truyền đột biến ở bệnh nhân 02. A, Vị trí các đột biến ở bệnh nhân trên gen CYP11B1. B, Sơ đồ phả hệ di truyền bệnh từ bố mẹ. Ia, Ib: bố và mẹ; hình vuông: nam giới, hình tròn: nữ giới. II: con. C, Kết quả trình tự trình tự gen.
3.4.2.3. Biểu hiện của đột biến trong tế bào động vật
Vấn đề đặt ra là liệu đột biến này có ảnh hưởng thế nào đến biểu hiện lâm sàng hóa sinh của người bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh? Để trả lời câu hỏi này, đột biến p.R51K được biểu hiện trong tế bào động vật COS-1, so sánh với kiểu gen bình thường. Tế bào COS-1 có nguồn gốc từ tế bào vỏ thượng thận của khỉ được nuôi ở tủ ấm CO2 (370C và 6% CO2) trên môi trường DMEM.
Bằng phương pháp tạo đột biến điểm trực tiếp và biểu hiện thể đột biến trong tế bào động vật theo nghiên cứu của Nguyễn Huy Hoàng và cộng sự năm 2008 [20], sản phẩm steroid được so sánh và phân tích khá chính xác (Hình 3.9).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.9. Phân tích Western blot về sự biểu hiện của CYP11B1 ở bệnh nhân 02 trong tế bào COS-1. Protein của CYP11B1-WT, p.R51K, và Mock (vector pSVL không mang cDNA của CYP11B1) được phân tách trên gel SDS/PAGE. Sau khi chuyển qua màng nitrocellulose, các protein được phát hiện bằng kháng thể thỏ kháng CYP11B người và được phát hiện trên phim bằng kit ECL.
Kết quả cho thấy sự biểu hiện của 11β-hydroxylase của đột biến p.R51K và wild-type đã được phát hiện với một băng có kích thước khoảng 48,6 kDa. Tế bào COS-1 sau khi được biến nạp với vector mang đột biến p.R51K và wild type được ủ với cơ chất 11-deoxycortisol để kiểm tra hoạt tính enzyme. Sau 72 h nuôi cấy, các steroid được tách chiết và phân tách trên sắc ký lớp mỏng.
Hình 3.10. Hoạt tính enzyme của 11-hydroxylase ở tế bào động vật COS-1 ở bệnh nhân 02.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Sau khi biến nạp 5 µM 11-deoxycortisol (RSS) và 0,6 µCi [3H]-RSS được thêm vào môi trường nuôi tế bào. Các thành phần của steorid được chuyển hóa từ cơ chất RSS tới cortisol (F) thí nghiệm được lặp lại 3 lần độc lập. Sự chuyển hóa RSS tới F của chủng wild-type được tính là 100%. Hoạt tính của đột biến được biểu hiện được so sánh với wild-type. Hoạt tính của đột biến p.R51K được so sánh với wild-type (Hình 3.10). Đột biến p.R51K giảm hoạt tính của 11β-hydroxylase chỉ còn 29 ± 4,5% so với wild-type.