Các protein đột biến và protein hoang dại được biểu hiện cùng với plasmid pBAdx4 trong tế bào COS-1 để phân tích và so sánh đặc tính của các thể đột biến. Sự
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
biểu hiện đồng thời với pbAdx đã được chứng minh là có ích trong việc tăng hoạt tính của CYP11B1 cũng như CYP11B2 trong hệ biểu hiện tế bào động vật COS-1 [20].
Sự biểu hiện của CYP11B1 hoang dại và đột biến trong tế bào động vật COS-1 được xác định lại bằng lai Western (Hình 3.6). Sự biểu hiện của 11β-hydroxylase của đột biến (p.E147D và p.N152K) và hoang dại đã được phát hiện với một băng có kích thước khoảng 48,6 kDa. Điều này chứng tỏ rằng 2 đột biến và hoang dại đã được biểu hiện trong tế bào động vật và không ảnh hưởng tới sự dịch mã của 11β-hydroxylase.
Hình 3.6. Phân tích lai Western về sự biểu hiện của CYP11B1 ở bệnh nhân 01trong tế bào COS-1. Các tế bào COS-1 sau biến nạp được nuôi trong môi trường có cơ chất 11-deoxycortisol (RSS). Protein của CYP11B1-WT, p.E147D, p.N152K và Mock (vector pSVL không mang cDNA của CYP11B1) được phân tách trên gel SDS- PAGE. Sau khi chuyển qua màng nitrocellulose, các protein được phát hiện bằng kháng thể thỏ kháng CYP11B người và được phát hiện trên phim bằng kit ECL.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.7. Hoạt tính của 11β-hydroxylase ở tế bào động vật COS-1. Sau khi biến nạp 5 µM 11-deoxycortisol (RSS) và 0,6 µCi [3
H]-RSS được thêm vào môi trường nuôi tế bào. Các thành phần của steorid được chuyển hóa từ cơ chất RSS tới cortisol (F), thí nghiệm được tiến hành 3 lần lặp lại độc lập. Sự chuyển hóa RSS tới F của thể hoang dại được tính là 100%. Hoạt tính của đột biến được biểu hiện được so sánh với thể hoang dại.
Sau khi sự biểu hiện protein được xác định bằng lai Western và tế bào COS-1 được ủ với cơ chất 11β-deoxycortisol để kiểm tra hoạt tính enzyme của protein biểu hiện. Sau 72 h nuôi cấy, các steroid được tách chiết và phân tách trên sắc ký lớp mỏng. Hoạt tính của của 2 đột biến p.E147D, và p.N152K được so sánh với thể hoang dại (Hình 3.7). Đột biến p.E147D giảm hoạt tính tới 52% so với thể hoang dại. Đột biến p.N152K giảm khoảng 64% hoạt tính so với thể hoang dại.