Đoạn gen CYP11B1 có kích thước khoảng 7 kb, bao gồm 9 exon và 8 intron, vì thế, 3 cặp mồi đặc hiệu được thiết kế để khuếch đại được toàn bộ đoạn gen (Hình 3.1).
Hình 3.2. Sơ đồ nhân đoạn genCYP11B1. Chiều dài gen CYP11B1 khoảng 7 kb gồm 9 exon, được chia thành 3 đoạn gen A (2,5 kb), B (1,6 kb) và C (2,3kb) để nhân toàn bộ gen.
Vì gen CYP11B1 và CYP11B2 có độ tương đồng rất cao (90%), nên khi thiết kế các cặp mồi cần phải chú ý các điểm khác nhau của 2 đoạn gen này để tránh nhân nhầm gen CYP11B2.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Tất cả các thành phần và chu trình của phản ứng PCR được tính toán sao cho nồng độ gen thu được tối ưu nhất, tránh xuất hiện các đoạn băng phụ và các thành phần bị dư. Số chu kì trong một phản ứng PCR thường là 25 – 35, tùy thuộc vào lượng bản mẫu ban đầu. Số chu kì thường không vượt quá 40 vì lúc đó hiệu quả khuếch đại bị giảm do cạn kiệt các thành phần của phản ứng hoặc có thể xuất hiện các sản phẩm phụ, ức chế phản ứng. Trong nghiên cứu này, với lượng DNA khuôn mẫu đưa vào là 50 ng DNA tổng số, 30 chu kì PCR được thiết lập như đã nêu ở phần 2.2.4. Đối với cặp mồi đặc hiệu đã được thiết kế, nhiệt độ cho giai đoạn gắn mồi được tính toán theo nhiệt độ nóng chảy của từng đoạn mồi theo công thức:
Tm = 20C x (A + T) + 40C x (G +C) + 3,30C
A, T, G, C: số lượng các bazơ nitơ
Để tiết kiệm thời gian, nhiệt độ gắn mồi tối ưu được lựa chọn để khuếch đại cùng lúc 3 đoạn gen A, B, C là 600
C trong 1 phút.
Tính chính xác và hiệu suất của enzyme DNA polymerase phụ thuộc nhiều vào hệ buffer sử dụng. Một thành phần quan trọng trong hệ đệm là Mg++
. Thành phần này giúp tạo phức với dNTP, cần thiết để gắn dNTP vào enzyme, kích thích hoạt tính của polymerase. Nồng độ Mg++ cao làm các DNA không biến tính hoàn toàn, sản phẩm bị ít đi. Tuy nhiên nồng độ Mg++
ít lại làm xấu quá trình kéo dài chuỗi DNA mới. Với DNA polymerase của hãng Dream Taq, Mg++
đã đượng bổ sung vào dung dịch buffer với nồng độ tối ưu, phù hợp với DNA polymerase.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.3. Điện di sản phẩm nhân gen CYP11B1. M: Marker chuẩn 1 kb; 1: đoạn gen nhân bằng mồi A (2,5 kb); 2: đoạn gen nhân bằng mồi B (1,6 kb); 3: đoạn gen nhân bởi mồi C (2,3 kb).
Với điều kiện được tính toán tối ưu của chu trình PCR, sản phẩm DNA thu được sau khi điện di trên gel agarose có kích thước hoàn toàn phù hợp với tính toán lý thuyết (Hình 3.2).
Kết quả điện di cho thấy, sản phẩm DNA là băng đặc hiệu, không xuất hiện băng phụ, tuy nhiên vẫn còn còn mồi dư và dNTP ở cuối bản gel. Vì thế, để đảm bảo quá trình đọc trình tự được chính xác, sản phẩm DNA cần được tinh sạch để loại bỏ các thành phần phụ.
Đoạn gen được tinh sạch bằng bộ Kit Gen Jet™ Gel Extraction của hãng Fermentas bằng phương pháp thôi gel. Với phương pháp này, các thành phần không mong muốn như mồi dư và dNTP sẽ bị loại bỏ khi tiến hành cắt gel, chỉ thu lại phần gel chứa đoạn gen mong muốn.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.4. Điện di sản phẩm tinh sạch genCYP11B1. M: Marker chuẩn 1 kb; 1: đoạn gen nhân bằng mồi A (2,5 kb); 2: đoạn gen nhân bằng mồi B (1,6 kb); 3: đoạn gen nhân bởi mồi C (2,3 kb).