L ời mở đầu
3.1.4. Chuẩn hóa các điều kiện phản ứng RT-PCR
3.1.4.1 Khảo sát điều kiện phản ứng RT-PCR đơn
a. Khảo sát và tối ưu nhiệt độ phản ứng đơn
Nhiệt độ phản ứng phiên mã ngược
Trong phản ứng phiên mã ngược (reverse transcription) thông qua sự hoạt
động của enzyme reverse transcriptase, nhiệt độ phản ứng phụ thuộc vào loại enzyme được sử dụng, nhiệt độ có thể từ 37oC đến 65oC. Trong phản ứng này, enzyme reverse transcriptase được khuyến cáo sử dụng nhiệt độ 50oC (Qiagen
Handbook). Tuy nhiên nhiệt độ bắt cặp của mồi lên mạch khuôn RNA cũng góp phần ảnh hưởng đến hiệu quả phiên mã ngược. Do đó nhiệt độ bắt cặp cho phản
ứng phiên mã ngược được khảo sát cho từng phản ứng đơn đối với từng cặp mồi riêng lẽ từ 45oC đến 55oC.
Kết quả cho thấy đối với cặp mồi MA-12F và MA-225R cho phản ứng
đơn phát hiện gen M của virút cúm A, nhiệt độ thích hợp cho phản ứng phiên mã ngược là 50oC (hình 3.11a). Đối với phản ứng phiên mã ngược phát hiện gen H1 của virút cúm A/H1N1-2009 sử dụng cặp mồi H1-224F và H1-525R, không thấy sự khác biệt đáng kể giữa 3 nhiệt độ phản ứng (hình 3.11b).
Hình 3.11. Khảo sát nhiệt độ phản ứng phiên mã ngược cho từng cặp mồi
a: cặp mồi MA-12F và MA-225R b: cặp mồi H1-224F và H1-525R 1a, 1b: 45oC ; 2a, 2b : 50oC; 3a, 3b: 55oC; M: thang 100bp
a b
~ 60 ~
Nhiệt độ phản ứng khuếch đại chuỗi
Trong phản ứng khuếch đại chuỗi, nhiệt độ bắt cặp (annealing temperature ~ Ta) giữa mồi và mạch khuôn là một yếu tố vô cùng quan trọng quyết định sự
thành công của phản ứng. Do đó chúng tôi tiến hành khảo sát nhiệt độ bắt cặp tối
ưu cho từng cặp mồi MA và HA riêng biệt cho từng mạch khuôn.
Nhiệt độ bắt cặp giữa mồi và mạch khuôn được tính toán như sau: Ta = 0,3 x Tm-primers + 0,7 x Tm-product – 14,9 [43] (i)
Trong đó: Tm-primers = 0,5 x (Tm-forward primer + Tm-reverse primer) (ii)
Như vậy chúng ta sẽ tính được nhiệt độ bắt cặp về mặt lý thuyết của cặp mồi MA-12F và MA-225R phát hiện đoạn sản phẩm gen MA như sau:
Ta có: Tm-MA-12F = 55oC; Tm-MA-225R = 59oC; Tm-product = 78oC (ii) => Tm-primers = 0,5 x (55oC + 59oC) = 57oC
(i) => Ta-MA = 0,3 x 57oC + 0,7 x 78oC – 14,9 = 56,8oC
Tương tự ta tính được nhiệt độ bắt cặp về mặt lý thuyết của cặp mồi H1- 224F và H1-525R phát hiện đoạn sản phẩm gen H1 như sau:
Ta có: Tm-H1-224F = 51oC; Tm-H1-525R = 54oC; Tm-product = 75oC (ii) => Tm-primers = 0,5 x (51oC + 54oC) = 52,5oC
(i) => Ta-H1 = 0,3 x 52,5oC + 0,7 x 75oC – 14,9oC = 53,35oC
Kết quả xác định nhiệt độ bắt cặp lý thuyết của hai cặp mồi MA-12F và MA-225R; H1-224F và H1-525R lần lượt là 56,8oC và 53,35oC. Từ đấy, chúng tôi tiến hành khảo sát nhiệt độ bắt cặp tối ưu cho từng phản ứng đơn với từng cặp mồi trên trong khoảng nhiệt độ từ 50oC đến 57oC.
~ 61 ~
Kết quả cho thấy đối với cặp mồi MA-12F và MA-225R nhiệt độ thích hợp cho phản ứng PCR đơn từ 50oC đến 55oC (hình 3.12a). Tương tự đối với cặp mồi H1-224F và H1-525R, nhiệt độ phù hợp cho phản ứng PCR đơn là 50oC và 53oC (hình 3.12b). Từ kết quả này có thể kết luận nhiệt độ bắt cặp thực tế thấp hơn nhiệt độ bắt cặp lý thuyết sẽ cho hiệu quả khuếch đại tốt hơn nhiệt độ bắt cặp cao hơn nhiệt độ bắt cặp lý thuyết.
b. Khảo sát và tối ưu nồng độ mồi phản ứng đơn
Trong hầu hết các phản ứng khuếch đại chuỗi PCR, nồng độ của các mồi (mồi xuôi và mồi ngược) được sử dụng bằng nhau và thường có nồng độ dao
động từ 0,05µM đến 1,0µM tùy thuộc từng phản ứng. Nồng độ mồi thấp thường sẽ cho kết quả sản phẩm khuếch đại không cao dẫn đến hiệu suất khuếch đại thấp. Ngược lại nồng độ mồi quá cao cũng ảnh hưởng đến chất lượng khuếch đại vì có thể dẫn đến hiện tượng primers-dimers và gắn nhầm vị trí trên khuôn mẫu [16]. Do đó việc khảo sát nồng độ mồi thích hợp cho từng phản ứng là cần thiết.
Hình 3.12. Khảo sát nhiệt độ
bắt cặp mồi phản ứng đơn
M: thang 100bp
a: cặp mồi MA-12F và MA- 225R; 1a: 50oC; 2a: 53oC; 3a: 55oC; 4a: 57oC b : cặp mồi H1-224F và H1- 525R; 1b: 57oC; 2b: 55oC; 3b: 53oC; 4b: 50oC 1 2 3 4 M M 1 2 3 4 a b
~ 62 ~
Đối với từng phản ứng đơn sử dụng cặp mồi MA-12F và MA-225R hoặc cặp mồi H1-224F và H1-525R, các nồng độ mồi được khảo sát từ nồng độ
0,1µM đến 1,0µM. Kết quả cho thấy đối với phản ứng đơn sử dụng cặp mồi MA-12F và MA-225R, nồng độ primer thích hợp cho phản ứng là 0,4µM. Ở
nồng độ mồi thấp nhất 0,1µM sản phẩm PCR tạo thành rất ít, trong khi ở nồng
độ 0,2µM, 0,5µM và 0,8µM kết quả khuếch đại không khác nhau đáng kể và hiệu quả thấp hơn nồng độ 0,4 µM (hình 3.13a).
Đối với phản ứng đơn sử dụng cặp mồi H1-224F và H1-525R, nồng độ
mồi thích hợp nhất là 0,8µM. Tương tự như trên nồng độ mồi thấp nhất 0,2µM kết quả sản phẩm khuếch đại kém nhất. Trong khi đó ở nồng độ mồi cao nhất 1,0µM sản phẩm khuếch đại cao kèm theo vệt mờ khác thường (smear) (hình 3.13b). Việc xuất hiện smear ở sản phẩm khuếch đại trong phản ứng sử dụng
Hình 3.13. Khảo sát nồng độ mồi cho phản ứng đơn
a: cặp mồi MA-12F và MA-225R; 1a: 0,1µM; 2a: 0,2µM; 3a: 0,4 µM; 4a: 0,5µM; 5a: 0,8µM; M: thang 100bp
b: cặp mồi H1-224F và H1-525R; 1b: 0,2µM; 2b: 0,4µM; 3b: 0,5 µM; 4b: 0,8µM; 5b: 1,0µM; M: thang 100bp
~ 63 ~
nồng độ mồi cao có thể do sự bắt cặp không chuyên biệt của mồi tạo nên các sản phẩm không mong muốn [16].
c. Khảo sát và tối ưu nồng độ hỗn hợp dNTP và MgCl2
MgCl2 (Mg2)
Nồng độ Mg2+ là yếu tố quan trọng liên quan đến sự thành công của phản
ứng PCR vì nó ảnh hưởng đến hoạt tính và tính chính xác của các enzyme polymerase, nhiệt độ biến tính DNA mạch khuôn và sản phẩm PCR, bắt cặp mồi,
độ chuyên biệt mồi và hình thành primer-dimer. Nồng độ Mg2+ quá cao có thể
tạo nên các sản phẩm khuếch đại không đặc hiệu (tạo nhiều band trên bảng điện di agarose); ngược lại nồng độ Mg2+ thấp sẽ làm giảm hiệu suất khuếch đại sản phẩm mong muốn. Nồng độ Mg2+ thường được sử dụng trong phản ứng PCR dao
động từ 0,5mM đến 5mM [16].
Trong nghiên cứu này chúng tôi khảo sát nồng độ Mg2+ riêng biệt cho từng phản ứng đơn riêng lẻ. Nồng độ Mg2+ được khảo sát trong khoảng từ 1mM
đến 4mM.
Hình 3.14. Kết quả khảo sát nồng độ Mg2+ trong phản ứng đơn a: cặp mồi MA-12F và MA-225R; 1a: 1mM; 2a: 1,5mM ; 3a: 2mM; 4a: 2,5mM; 5a: 3mM; 6a: 3,5mM; 7a: 4mM
b: cặp mồi H1-224F và H1-525R; 1b: 1mM; 2b: 1,5mM; 3b: 2mM; 4b: 2,5mM; 5b: 3mM; 6b: 3,5mM; 7b: 4mM
M : thang 100bp
1 2 3 4 5 6 7 M 1 2 3 4 5 6 7 M
~ 64 ~
Kết quả cho thấy đối với phản ứng đơn sử dụng cặp mồi MA-12F và MA- 225R, nồng độ Mg2+ thấp < 2mM hiệu quả khuếch đại rất kém (không thấy sản phẩm khuếch đại trên hình điện di); nồng độ Mg2+ 2mM cho thấy sản phẩm khuếch đại được tao ra nhưng khá thấp (vạch sản phẩm mờ); nồng độ Mg2+ trong khoảng 2,5mM – 4mM cho phản ứng khuếch đại tốt và không có sự chênh lệch
đáng kể (hình 3.14a). Đối với phản ứng đơn sử dụng cặp mồi H1-224F và H1- 525R, nồng độ Mg2+ < 2,5mM cho phản ứng khuếch đại kém nhất ; nồng độ
Mg2+ cho hiệu quả khuếch đại sản phẩm mong muốn tốt nhất trong nghiên cứu nằm trong khoảng 3,5mM - 4mM (hình 3.14b).
dNTP
Nồng độ dNTP có thể ảnh hưởng đến hiệu quả, tính đặc hiệu và độ chính xác của phản ứng khuếch đại. Nồng độ mỗi dNTP thường được sử dụng trong phản ứng khuếch đại PCR nằm trong khoảng 0,02mM - 0,4mM.
Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành khảo sát nồng độ dNTP cho từng phản ứng đơn từ 0,2mM đến 0,8mM. Kết quả cho thấy nồng độ tốt nhất cho cả hai phản ứng đơn là 0,4mM. Nồng độ dNTP cao hơn hay thấp hơn 0,4mM
đều cho kết quả khuếch đại kém hơn (hình 3.15). Kết quả này cũng cho thấy nồng độ dNTP cao có thểức chế phản ứng PCR [29].
Hình 3.15. Kết quả khảo sát nồng độ dNTP trong phản ứng đơn
a: cặp mồi MA-12F và MA-225R; 1a: 0,2mM; 2a: 0,4mM; 3a: 0,6mM; 4a: 0,8mM b: cặp mồi H1-224F và H1-525R; 1b: 0,2mM; 2b: 0,4mM; 3b: 0,6mM; 4b: 0,8mM M: thang 100bp
~ 65 ~
Để hoạt động một cách hiệu quả, enzyme DNA polymerase yêu cầu Mg2+ tự do (ngoài số lượng bám vào dNTP và DNA). Đây là một trong các lý do tại sao tăng nồng độ dNTP có thể nhanh chống ức chế phản ứng PCR, ngược lại tăng nồng độ Mg2+ thường cho kết quả tốt hơn [16].
d. Khảo sát và tối ưu thời gian phản ứng đơn
Thời gian cho từng phản ứng RT-PCR đơn được khảo sát nhằm tối ưu thời gian cho từng phản ứng. Trong đó cả thời gian cho phản ứng phiên mã ngược và thời gian cho phản ứng khuếch đại chuỗi đều được khảo sát.
Trong hầu hết các phản ứng phiên mã ngược thời gian được khảo sát từ 15
đến 30 phút [10, 48]. Do đó chúng tôi khảo sát khoảng thời gian phiên mã ngược từ 10 phút đến 30 phút. Kết quả trong phản ứng đơn sử dụng cặp mồi MA-12F
Hình 3.16. Khảo sát thời gian phiên mã ngược phản ứng đơn
a: cặp mồi MA-12F và MA-225R; 1a : 30 phút; 2a: 20 phút; 3a: 15 phút; 4a: 10 phút; M: thang 100bp
b: cặp mồi H1-224F và H1-525R; 1b: 30 phút; 2b: 20 phút; 3b: 15 phút; 4b: 10 phút; M: thang 100bp
~ 66 ~
và MA-225R cho thấy sự khuếch đại không có sự khác biệt đáng kể giữa các thời gian được khảo sát (hình 3.16a). Trong khi đó phản ứng đơn sử dụng cặp mồi H1-224F và H1-525R, thời gian cho phản ứng khuếch đại không có sự khác biệt từ 15 phút đến 30 phút. Nhưng nếu giảm thời gian phiên mã ngược xuống còn 10 phút thì kết quả khuếch đại không tốt bằng các khoảng thời gian khác trong cùng điều kiện phản ứng (hình 3.16b).
Đối với giai đoạn khuếch đại chuỗi, các khoảng thời gian được khảo sát là thời gian giai đoạn biến tính, giai đoạn kéo dài và giai đoạn kết thúc. Trong giai
đoạn biến tính và kéo dài thời gian được khảo sát là 1 phút và 30 giây. Giai đoạn kết thúc thời gian được khảo sát là 10 phút và 5 phút. Kết quả cho thấy trong phản ứng đơn sử dụng cặp mồi MA-12F và MA-225R, thời gian biến tính giữa 1
Hình 3.17. Khảo sát thời gian trong phản ứng khuếch đại chuỗi (PCR) đơn
a. cặp mồi MA-12F và MA-225R; b. H1-224F và H1-525R 1: thời gian biến tính 1 phút, kéo dài 30 giây, kết thúc 10 phút 2: thời gian biến tính 1 phút, kéo dài 1 phút, kết thúc 10 phút 3: thời gian biến tính 30 giây, kéo dài 1 phút, kết thúc 10 phút 4: thời gian biến tính 1 phút, kéo dài 1 phút, kết thúc 5 phút M : thang 100bp
~ 67 ~
phút và 30 giây không có sự khác biệt, nhưng thời gian kéo dài 1 phút cho kết quả tốt hơn 30 giây (hình 3.17a). Đối với phản ứng đơn sử dụng cặp mồi H1- 224F và H1-525R, thời gian biến tính cũng như thời gian kéo dài không có sự
khác biệt giữa 1 phút và 30 giây (hình 3.17b). Trong khi đó đối với thời gian kết thúc ở cả hai phản ứng đơn sử dụng 2 cặp mồi khác nhau kết quả cho thấy thời gian dài 10 phút tốt hơn thời gian 5 phút (hình 3.17).
3.1.4.2. Khảo sát điều kiện phản ứng multiplex RT-PCR
a. Khảo sát và tối ưu nhiệt độ trong phản ứng multiplex
Tương tự trong phản ứng đơn, trong phản ứng multiplex nhiệt độ bắt cặp của các cặp mồi được khảo sát và phân tích từ bước phiên mã ngược đến bước khuếch đại chuỗi để nhằm tìm nhiệt độ thích hợp nhất cho cả hai cặp mồi trong cùng một phản ứng.
Trong phản ứng phiên mã ngược chúng tôi khảo sát nhiệt độ bắt cặp từ
45oC đến 55oC, tương tự trong phản ứng đơn. Kết quả cho thấy nhiệt độ thích hợp nhất trong bước phiên mã ngược của phản ứng multiplex là 45oC. Ở nhiệt độ
55oC kết quả khuếch đại kém nhất (hình 3.18).
Hình 3.18. Khảo sát nhiệt độ phiên mã ngược trong phản ứng multiplex
M: thang 100bp;
1: 45oC; 2: 50oC; 3: 55oC
~ 68 ~
Trong phản ứng khuếch đại chuỗi, nhiệt độ bắt cặp của các cặp mồi cũng
được khảo sát từ 50oC đến 57oC. Nhiệt độ thích hợp nhất cho phản ứng multiplex PCR là 50oC. Các nhiệt độ bắt cặp khác cũng có khả năng cho bắt cặp khuếch
đại nhưng cho quả kém hơn (hình 3.19).
Từ hình 3.19 cho thấy, ở các nhiệt độ từ 53oC đến 57oC, hiệu quả khuếch
đại gen M khá tốt, ngược lại hiệu quả khuếch đại gen H1 kém hơn. Trong khi đó
ở nhiệt độ 50oC hiệu quả khuếch đại cả gen M và gen H1 như nhau và cho hiệu quả tốt. Điều này có thể do sự chênh lệch nhiệt độ bắt cặp của hai cặp mồi dùng trong phản ứng multiplex (Ta-MA = 56,8oC; Ta-H1 = 52,5oC). Ở nhiệt độ cao (53oC – 57oC), khả năng cạnh tranh bắt cặp của cặp mồi MA-12F và MA-225R có thể
tốt hơn cặp mồi H1-224F và H1-525R dẫn đến việc sử dụng các thành phần khác trong phản ứng tối ưu hơn. Ngược lại ở 50oC, khả năng cạnh tranh và sử dụng các thành phần khác trong phản ứng của hai cặp mồi MA-12F và MA-225R; H1-
1 2 3 4 M Hình 3.19. Khảo sát nhiệt độ bắt cặp trong phản ứng khuếch đại chuỗi multiplex
1: 50oC; 2: 53oC; 3: 55oC; 4: 57oC; M: thang 100bp
~ 69 ~
224F và H1-525R như nhau do đó hiệu quả khuếch đại gen M và H1 không khác nhau.
b. Khảo sát và tối ưu nồng độ mồi trong phản ứng multiplex
Trong phản ứng multiplex PCR, nồng độ các cặp mồi được bổ sung vào phản ứng rất quan trọng vì chúng có thể tương tác, cạnh tranh ảnh hưởng đến kết quả khuếch đại, đặc biệt trong chẩn đoán có thể dẫn đến âm tính hoặc dương tính giả.
Do đó chúng tôi đã khảo sát nồng độ các cặp mồi được bổ sung vào phản
ứng multiplex từ nồng độ 0.1µM đến 0,8µM. Kết quả cho thấy nồng độ mồi không có sự tương tác cũng như cạnh tranh nhau trong cùng phản ứng. Nồng độ
mồi cao nhất cho kết quả khuếch đại tốt nhất và ngược lại đối với nồng độ mồi thấp nhất (hình 3.20). 1 2 3 4 5 M Hình 3.20. Khảo sát nồng độ mồi cho phản ứng multiplex 1: 0,1µM/mỗi mồi 2: 0,2µM/mỗi mồi 3: 0,4µM/mỗi mồi 4: 0,5µM/mỗi mồi 5: 0,8µM/mỗi mồi M: Thang 100bp
~ 70 ~
c. Khảo sát và tối ưu nồng độ dNTP và MgCl2 trong phản ứng multiplex
MgCl2 (Mg2+)
Trong phản ứng đơn sử dụng cặp mồi MA-12F và MA-225R, nồng độ
Mg2+ thích hợp là 2,5mM – 4mM ; trong phản ứng sử dụng cặp mồi H1-224F và H1-525R là 3,5mM – 4mM. Trong phản ứng multplex sử dụng đồng thời 2 cặp mồi trên, chúng tôi khảo sát lại nồng độ Mg2+ từ 2mM đến 5mM.
Tương tự trong phản ứng đơn, trong phản ứng multiplex nồng độ Mg2+ càng cao, kết quả khuếch đại càng tốt. Nồng độ Mg2+ thích hợp cho phản ứng multiplex trong khoảng 4mM – 5mM. Nồng độ Mg2+ thấp (< 4mM) cho kết quả
khuếch kém hơn và sản phẩm khuếch đại không thể phát hiện được nếu nồng độ
Mg2+ < 2,5mM (hình 3.21). Hình 3.21. Kết quả khảo sát nồng độ Mg2+ trong phản ứng multiplex. 1: 1,5mM; 2: 2mM; 3: 2,5mM; 4: 3mM; 5: 4mM; 6: 5mM M: thang 100bp