L ời mở đầu
2.3.13. Định lượng plasmid DNA
DNA plasmid được định lượng tương đối bằng thiết bị GeneQuant II. Mỗi dung dịch DNA plasmid được đo ở 2 bước sóng 260nm và 280nm. Từ giá trị hấp phụ ở bước sóng 260nm (A260) chúng ta xác định được nồng độ của các axít nucleic trong mẫu đồng thời xác định được độ tinh sạch của chúng thông qua tỷ
lệ hấp phụ ở bước sóng 260nm (A260) và 280nm (A280). Nồng độ DNA mạch đôi (dsDNA) của dung dịch cần đo được tính bằng công thức: Đơn vị chuyển đổi
hấp phụ x giá trị hấp phụ x Độ pha loãng. Giá trị tỷ lệ A260/A280 nằm trong
khoảng 1,8 – 2 chỉ thịđộ sạch của axít nucleic trong mẫu có thể chấp nhận được.
Bảng 2.3. Chuyển đổi 1 đơn vị hấp phụ ở bước sóng 260nm.
1 A260 unit Nồng độ (µg/ml) dsDNA 50 ssDNA 33 RNA 40 Oligonucleotides 20-30 2.3.14. Phương pháp giải trình tự[4]
Chúng tôi sử dụng hệ thống giải trình tự DNA tự động CEQTM 8000 Genetic Analysis System để giải trình tự các mẫu DNA nhằm xác định trình tự
gốc gene NA cũng như để so sánh sự thay đổi về trình tự (nếu có) của các plasmid DNA mang gene NA sau khi biểu hiện trong phản ứng chuyển nhiễm. Hệ thống CEQTM 8000 này giải trình tự theo nguyên tắc của Sanger, tức là dựa vào sự tổng hợp chuỗi mới có bổ sung các dideoxynucleotides (ddNTP) đánh
~ 44 ~
dấu phát huỳnh quang. Các đoạn DNA ngắn với kích thước khác nhau mới tổng hợp xong chứa các ddNTP này sẽ được điện di trong ống mao dẫn. Sau đó, nhờ đầu laser đọc các trình tự tương ứng dựa vào các màu huỳnh quang khác nhau và xuất ra máy tính qua phần mềm CEQTM 8000 Genetic Analysis System.
2.3.14.1. Tinh sạch sản phẩm DNA cần giải trình tự
Cắt mẫu gel chứa DNA cần tinh sạch bằng dao sắc, sạch. Cân trọng lượng gel. Bổ sung ba lần thể tích Buffer QG vào một thể tích gel (100 mg ~ 100 μl), thường khoảng 600-800 μl. Ủ ở 500C trong 10 phút cho đến khi gel tan hoàn toàn, có thể vortex type sau mỗi 2-3 phút trong quá trình ủ. Đặt cột lọc QIAquick vào tube 2 ml sẵn có. Cho mẫu vào cột lọc QIAquick, ly tâm 10.000 rpm trong 1 phút. Loại bỏ dịch lọc và đặt cột lọc lại tube ban đầu. Cho thêm 500 μl Buffer QG vào cột lọc và ly tâm 10.000 rpm trong 1 phút. Bước rửa, cho 750 μl Buffer PE vào cột lọc và ly tâm 10.000 rpm trong 1 phút. Ly tâm lại 10.000 rpm trong 1 phút để loại bỏ hoàn toàn dịch rửa. Sau khi rửa, chuyển cột lọc sang một tube 1,5 ml mới, sạch, ghi tên mẫu. Để hòa tan DNA, cho 25 μl Buffer EB (10 mM Tris- Cl, pH 8,5) vào giữa màng của cột lọc. Để yên trong một phút rồi ly tâm ở
10.000 rpm trong 1 phút.
2.3.14.2. PCR đánh dấu sản phẩm DNA cần giải trình tự
PCR đánh dấu các đoạn DNA đã tinh sạch bằng bộ Kit DTCS Quick Start. Thành phần phản ứng PCR đánh dấu: 8 μl sản phẩm DNA đã tinh sạch, 2 μl Sequencing primer 1,6 μM, 8 μl DTCS Quick Start Master Mix và bổ sung nước cất vô trùng đến thể tích cuối cùng 20 μl. Chương trình đánh dấu: 30 chu kỳ cho 960C trong 20 giây, 500C trong 20 giây và 600C trong 4 phút, kết thúc giữ lạnh ở
~ 45 ~
2.3.14.3. Xử lý mẫu DNA và nạp mẫu vào máy giải trình tự
Chuyển sản phẩm đánh dấu vào eppendorf 1,5 ml. Bổ sung 5 μl hỗn hợp Stop Solution/Glycogen bao gồm 2μl Sodium Acetate 3M, 2μl Na2-EDTA 100mM, và 1μl Glycogen 20mg/ml, trộn đều. Cho 60μl Ethanol 95% (v/v) vào, vortex nhẹ, ly tâm 14.000rpm ở 4oC trong 15 phút. Cẩn thận hút bỏ dịch nổi, rửa 2 lần bằng 200 μl Ethanol 70%, ly tâm 14.000rpm ít nhất 2 phút ở 4oC. Hút bỏ
dịch nổi, làm khô cặn còn lại bằng máy ly tâm chân không trong 10 phút. Bổ
sung 40μl dung dịch Sample Loading Solution vào mỗi mẫu. Chuyển mẫu DNA vào các giếng trên plate thích hợp theo từng hàng, bổ sung một giọt dầu khoáng (mineral oil) lên bề mặt. Lập chương trình và chạy máy.
Hình 2.4. Nguyên tắc máy giải trình tự DNA tựđộng.
(1) Xilanh chứa gel polyacrylamide dùng để bơm gel polyacrylamide vào các ống mao dẫn. (2) Bình chứa dung dịch thải. (3) Phiến nhựa 96giếng chứa các mẫu cần phân tích trình tự DNA. Nạp mẫu vào phiến nhựa theo hàng ngang 8 giếng. (4) Hàng kim hút mẫu và dung dịch buffer đưa vào ống mao dẫn. (5) Hệ thống các ống mao dẫn. (6) Đèn laser đọc các trình tự DNA đã được gắn chất phát huỳnh quang. (7)Hệ thống nối với máy vi tính thu nhận dữ liệu.
~ 46 ~ FP TP TP PPV + = FN TP TP Pse + = FP TN TN Psp + = 2.3.15. Các phương pháp thống kê[1, 33] 2.3.15.1 Độ nhạy
Độ nhạy của một xét nghiệm chẩn đoán được định nghĩa là tỷ lệ người mang bệnh có kết quả xét nghiệm dương tính và được tính theo công thức sau:
Trong đó: Pse: độ nhạy; TP: số lượng dương tính thật (true positive); FN: số lương âm tính giả (false negative)
2.3.15.2. Độđặc hiệu
Độđặc hiệu của một xét nghiệm chẩn đoán được định nghĩa là tỷ lệ người không mang bệnh có kết quả xét nghiệm âm tính và được tính theo công thức sau:
Trong đó: Psp: độ đặc hiệu; TN: số lượng âm tính thật (true negative); FP: số lượng dương tính dương tính giả (false positive)
2.3.15.3. Giá trị tiên đoán dương
Giá trị tiên đoán dương (positive predictive value ~ PPV) được định nghĩa là tỷ lệ người có kết quả xét nghiệm dương tính thật sự mang bệnh và được tính theo công thức sau:
Trong đó: PPV: giá trị tiên đoán dương; TP: số lượng dương tính thật (true positive); FP: số lượng dương tính giả (false positive)
~ 47 ~ FN TN TN NPV + = 73 ) 05 , 0 ( 05 , 0 95 , 0 ) 96 , 1 ( ) 1 ( 2 2 2 2 = = − = + x x w P x xP Z FN TP α se se
2.3.15.4. Giá trị tiên đoán âm
Giá trị tiên đoán âm (negative predictive value ~ NPV) được định nghĩa là tỷ lệ người có kết quả xét nghiệm âm tính thật sự không mang bệnh và được tính theo công thức sau:
Trong đó: NPV: giá trị tiên đoán âm; TN: số lượng âm tính thật (true negative); FN: số lượng âm tính giả (false negative)
2.3.15.5. Ước tính cỡ mẫu cho phân tích độ nhạy và độ đặc hiệu
Cỡ mẫu được ước tính trong nghiên cứu giúp so sánh độ nhạy, độđặc hiệu của phương pháp RT-PCR do Viện Pasteur TP.HCM sản xuất so với phương pháp real-time RT-PCR (RRT-PCR) của CDC. Với hy vọng phương pháp RT- PCR sẽ đạt được độ nhạy và độđặc hiệu lần lượt vào khoảng 95% và 99% với số
chỉ số dao động trên dưới 5% so với phương pháp RRT-PCR và biết rằng tỷ lệ
mắc bệnh cúm H1N1-2009 trong quần thể được xét nghiệm tại Viện Pasteur TP.HCM vào khoảng 35% (số liệu Viện Pasteur TP.HCM), chúng tôi ước tính số
mẫu được thực hiện so sánh đểđạt độ tin cậy thống kê là 95% (α=0,05) như sau: Với số liệu trên, chúng ta có thể ước tính chỉ số TP + FN:
Trong đó: 2
α
Z là hằng số phân phối chuẩn; w là sai số của hai xác suất dương tính thật và âm tính thật.
Với tỷ lệ hiện hành ước tính của bệnh là 35%, số lượng cỡ mẫu cần thiết
~ 48 ~ 16 ) 05 , 0 ( 01 , 0 99 , 0 ) 96 , 1 ( ) 1 ( 2 2 2 2 = = − = + x x w P x xP Z TN FP α sp sp 208 35 , 0 73 = = + = dis se p FN TP n 25 65 , 0 16 ) 1 ( = = − + = dis sp P TN FP n
Trong đó: nse cỡ mẫu ước tính cho độ nhạy; Pdis là tỷ lệ lưu hành bệnh trong quần thể.
Tương tự có thể ước tính chỉ số FP+TN:
Do đó, số lượng cỡ mẫu cần thiết đểước tính độđặc hiệu là:
Trong đó: nsp là cỡ mẫu ước tính cho độđặc hiệu.
Trong trường hợp này, chúng ta có hai ước tính khá khác nhau. Do đó chúng tôi quyết định sẽ chọn cỡ mẫu ≥ 208 để có thể đạt được tỷ lệ độ nhạy mong muốn đồng thời sẽ khảo sát lại độ đặc hiệu của phương pháp trên cỡ mẫu lớn.
~ 49 ~
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Nghiên cứu xây dựng quy trình chế tạo kit xét nghiệm
3.1.1. Thiết kế mồi
3.1.1.1. So sánh trình tự và thiết kế mồi
Thiết kế mồi nhằm mục đích đạt được sự cân bằng về tính đặc hiệu (specificity) và tính hiệu quả (efficiency) của phản ứng khuếch đại [44]. Hiện nay các phần mềm sinh học phân tử dùng để thiết kế mồi thường dựng sẵn các thông số chuẩn nhằm cân bằng giữa hai mục tiêu này. Các thông số cần được quan tâm trong thiết kế mồi khuếch đại là chiều dài mồi, vị trí nucleotide ở đầu cuối 3’, số
lượng GC và nhiệt độ tan chảy Tm (melting temperature) của mồi [2]. Tuy nhiên việc ứng dụng PCR trong chẩn đoán y khoa, các thông số và điều kiện phản ứng thường được điều chỉnh nhằm tăng chỉ số đặc hiệu để hạn chế đến mức tối thiểu kết quả dương tính giả [12].
Hình 3.1. Kết quả so sánh độ tương đồng các gen H, N và M trên NCBI
~ 50 ~
Các gen mã hóa protein M (gen M), mã hóa protein heamagglutinin (gen H) và mã hóa protein neuraminidase (gen N) của chủng virút cúm A/H1N1 gây
đại dịch tại khu vực phía nam Việt Nam được Viện Pasteur TP.HCM giải trình tự, phân tích và so sánh với các chủng virút cúm gây đại dịch trên thế giới. Kết quả cho thấy trình tự gen M, gen H và gen N của chủng virút cúm đại dịch tại Việt Nam có độ tương đồng 98% – 99% với các trình tự gen tương ứng của các chủng virút cúm gây đại dịch trên thế giới năm 2009 (hình 3.1)
Mồi dùng để phát hiện chuyên biệt gen M virút cúm A được thiết kế dựa chủ yếu vào vùng trình tự bảo tồn của gen này ở tất cả các thứ type của virút thuộc type A (hình 3.2a). Kết quả cặp mồi MA-12F và MA-225R đã được chọn
để phát hiện gen M của virút cúm trong nghiên cứu này (hình 3.3a).
Mồi dùng để phát hiện virút cúm A/H1N1 gây đại dịch năm 2009 được thiết kế tại vị trí có độ bảo tồn cao trên gen H1 của các chủng gây đại dịch tại
Hình 3.2. Trình tự gen M và gen H1 bảo tồn
a. Trình tự gen M bảo tồn của virút cúm A
b. Trình tự gen H1 bảo tồn của virút cúm A/H1N1/2009
a
~ 51 ~
Việt Nam và trên thế giới đồng thời không có khả năng phát hiện virút cúm mùa cùng thứ type H1N1 (hình 3.2b). Kết quả cặp mồi H1-224F và H1-525R được chọn sử dụng trong nghiên cứu này (hình 3.3b).
3.1.1.2. Kiểm tra độ đặc hiệu của mồi được thiết kế
Để kiểm tra hiệu quả bắt cặp và độ đặc hiệu của hai cặp mồi được thiết kế, chúng tôi tiến hành chạy phản ứng khuếch đại sử dụng từng cặp mồi riêng rẽ với một số tác nhân vi khuẩn và virút có khả năng gây bệnh qua đường hô hấp. Các vi khuẩn được khảo sát là vi khuẩn Streptococcus pneumoniae, Klebsiella pneumoniae, Haemophillus influenza và Escherichia coli. Virút được khảo sát là các virút cúm mùa A/H1N1 (A/H1N1s), A/H3N2, A/H5N1, virút cúm B và virút cúm đại dịch 2009 A/H1N1.
Kết quả cho thấy đối với cặp mồi MA-12F và MA-225R có khả năng phát hiện được các virút cúm type A (virút cúm A/H1N1s, A/H3N2, A/H5N1), không khả năng phát hiện virút cúm B và các vi khuẩn trong nghiên cứu (hình 3.4a). Gen M là một trong 2 gen được sử dụng để phân biệt các thứ type virút cúm [51] do đó việc cặp mồi MA-12F và MA-225R được thiết kế dựa trên trình tự bảo tồn gen M của tất cả các virút cúm type A nên chỉ có thể phát hiện các virút cúm
Hình 3.3: Các mồi được thiết kếđể phát hiện virút cúm A/H1N1-2009
a. mồi phát hiện gen M; b. mồi phát hiện gen H1 virút đại dịch 2009
~ 52 ~
thuộc type này và không thể phát hiện các virút cúm thuộc các type khác như
type B và C.
Trong khi đó, kết quả cho thấy cặp mồi H1-224F và H1-525R chỉ có khả
năng phát hiện virút cúm đại dịch A/H1N1-2009 và không phát hiện các chủng virút cúm khác cùng type (virút cúm A/H1N1s, H/H3N2, A/H5N1) và khác type (cúm B) cũng như các vi khuẩn trong nghiên cứu (hình 3.4b).
3.1.2. Điều chế enzyme Taq polymerase
3.1.2.1. Biểu hiện và tinh sạch Taq polymerase
Plasmid tái tổ hợp pTTQ18 mang đoạn gen mã hóa Taq polymerase (được hỗ trợ bởi TS. Ferralli, Đại học Salisbury) được biến nạp vào tế bào E.coli khả
nạp. Các khuẩn lạc trắng (20 khuẩn lạc) được chọn lọc và kiểm tra chủng mong
Hình 3.4. Kiểm tra độđặc hiệu của mồi
a: cặp mồi MA-12F và MA-225R b: cặp mồi H1-224F và H1-525R 1a: A/H1N1-2009; 2a: A/H1N1s; 3a: A/H3N2; 4a: A/H5N1; 5a: S. pneumoniae; 6a: K. pneumoniae; 7a: H. influenza; 8a: E. coli; 9a: cúm B
1b: S. pneumoniae; 2b: K. pneumoniae; 3b: H. influenza; 4b: E. coli; 5b: cúm B; 6b: A/H1N1-2009; 7b: A/H1N1s; 8b: A/H3N2; 9b: A/H5N1. M: thang 100bp a b 1 2 3 4 5 M 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 M
~ 53 ~
muốn (hình 3.5b). Kết quả khuếch đại đoạn gen mã hóa Taq polymerase từ
plasmid được tách chiết từ khuẩn lạc chọn lọc cho thấy kích thước tương tự kích thước mong muốn (~2,6kb) khi so với thang chuẩn (hình 3.5c). Đoạn gen mã hóa
được giải trình tự và có kết quả trùng khớp với trình tự gốc. Sau đó các khuẩn lạc này tiếp tục được tăng sinh và được kích thích hoặc không được kích thích bằng IPTG.
Sau khi tế bào được kích thích sản xuất, Taq polymearse được tinh sạch và bảo quản trong dung dịch đệm (Tris HCl 50mM pH 7,9; NaCl 100mM, DTT 0,5mM; triton X-100 1% và glycerol 50%) ở -20oC. Kết quả điện di 10µl sản
Hình 3.5. Kết quả biến nạp plasmid tái tổ hợp pTTQ18 vào E. Coli. a. Sơđồ plasmid pTTQ18
b. Khuẩn lạc của chủng mang plasmid được biến nạp
c. Kiểm tra khuẩn lạc được chọn: 1. thang 500bp; 2. plasmid được tách chiết; 3. Sản phẩm khuếch đại gen mã hóa Taq polymerase;M. Thang DNA
1 2 3 2,5kb 5,0kb c b a
~ 54 ~
phẩm tinh sạch từ nguồn được kích thích trên gel SDS-polyacrylamide (SDS- PAGE) xuất hiện vạch protein có kích thước bằng với kích thước protein chứng dương (Taq polymerase thương mại) khoảng 94kDa. Ngược lại sản phẩm tinh sạch từ nguồn không được kích thích không thấy xuất hiện vạch protein tương
ứng (hình 3.6). Như vậy chứng tỏ chủng vi khuẩn mang plasmid tái tổ hợp có khả năng tạo ra protein Taq polymerase khi được kích thích bằng IPTG.
3.1.2.2. Hoạt tính Taq polymerase
Để đánh giá hoạt tính enzyme, chúng tiến hành so sánh sản phẩm Taq
polymerase được tinh sạch với enzyme Taq polymerase thương mại bằng cách kiểm tra cùng sản phẩm khuếch đại.
Hình 3.6. Kết quả phân tích SDS-PAGE
Taq polymerase.
1. chứng dương Taq polymerase thương mại 5U; 2. 10µl sản phẩm tinh sạch từ
nguồn được kích thích; 3. 10µl sản phẩm tinh sạch từ nguồn không được kích thích; M. Marker protein 1 2 3 M 116kDa 90kDa Hình 3.7. Kết quả kiểm tra hoạt tính enzyme.
1. 1µl Taq polymerase tinh sạch 2. 0,5µl Taq polymerase tinh sạch 3. 0,1µl Taq polymerase tinh sạch 4. 2U Taq polymerase thương mại M. Marker DNA
~ 55 ~
Kết quả khuếch đại cho thấy 1µl sản phẩm tinh sạch chứa hoạt tính Taq polymerase tương đương với 2U Taq polymerase thương mại (hình 3.7). Với kết quả này, nồng độ hoạt tính của sản phẩm enzyme polymerase tinh sạch vào khoảng 2U/µl. Trong 200ml dung dịch nuôi cấy, chúng tôi thu được 10ml dung dịch enzyme tinh sạch với nồng độ hoạt tính 2U/µl, như vậy năng suất tạo enzyme là 500.000U/lít dịch nuôi cấy. Kết quả này tương tự kết quả sản xuất
Taq polymerase của Leelayuwat năm 1997 [27]. Trong nghiên cứu của Pluthero
đã sản xuất được 1.000.000U/lít dịch nuôi cấy ban đầu [40].
Toàn bộ quy trình biểu hiện và tinh sạch Taq polymerase trong nghiên cứu này được thực hiện theo quy trình đã được dựng sẵn của TS. Ferralli, đại học Salisbury (Mỹ).
3.1.3. Khảo sát hỗn hợp enzyme phản ứng RT-PCR
Phản ứng khuếch đại chuỗi kết hợp phiên mã ngược (RT-PCR) là phản
ứng sử dụng bản mẫu ban đầu (mạch khuôn) là các phân tử RNA (thay vì phân