L ời mở đầu
1.6.3. Chọn lựa phương pháp chuẩn tham khảo
Việc chọn lựa phương pháp chuẩn thích hợp là yếu tố rất quan trọng khi so sánh kết quả hợp lệ. Ví như các phương pháp huyết thanh học thường không được sử dụng để so sánh với các phương pháp phát hiện vi sinh trực
~ 27 ~
tiếp hay các tiêu chuẩn tham khảo về mặt lâm sàng thường không phù hợp khi biểu hiện lâm sàng không nhạy hay chuyên biệt. Các phương pháp tham khảo không được thương mại (non-commercial) hay tự chế (in house) chỉ được sử dụng hợp lệ khi đã được phê chuẩn thích hợp. Trong vài trường hợp chuẩn tham khảo có thể là kết quả kết hợp từ hai hay nhiều phương pháp khác nhau thay cho kết quả từ phương pháp chuẩn.
~ 28 ~ Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu 2.1.1. Thiết bị - Dụng cụ 2.1.1.1. Thiết bị − Phòng an toàn sinh học cấp 2
− Tủ cấy an toàn sinh học cấp 2 Microflow ABS 1200 (BIOQUELL)
− Máy ổn nhiệt ướt Polystat 5A (BIOBLOCK SCIENTIFIC)
− Máy vortex (BIOBLOCK SCIENTIFIC)
− Tủ lạnh 4 – 8oC (SANYO)
− Tủđông sâu: -30oC, -80oC (SANYO)
− Khung đổ gel SRD
− Bộ nguồn điện di EC 105 (APPARATUS)
− Thiết bịđiện di Wide Mini-Sub® Cell BT (BIO-RAD)
− Thiết bịđiện di Mini-Protean® Tetra cell (BIO-RAD)
− Thiết bị soi DNA bằng tia UV (BIOBLOCK)
− Máy chụp hình gel ChemiDoc-XRS (BIO-RAD)
− Máy luân nhiệt GeneAmp® PCR System 9700 (APPLIED BIOSYSTEMS)
− Máy Realtime PCR Realplex4(EPPENDORF)
− Máy ly tâm 5415C, 5417C (EPPENDORF)
− Máy ly tâm strip 166-0603EDU (BIO-RAD)
~ 29 ~ − Cân phân tích BP61 (SATORIUS)
− Nồi hấp tiệt trùng (ALP)
2.1.1.2. Dụng cụ
− Micropipette: 10µl, 20µl, 100µl, 200µl, 1000µl (EPPENDORF, GILSON)
− Pipet aid (EPPENDORF)
− Pipette nhựa Corstar các loại: 1ml, 2ml, 5ml, 10ml (CORNING)
− Đầu típ có lọc: 10µl, 20µl, 100µl, 200µl, 1000µl (GREINER)
− Đầu côn vàng 200µl, xanh 1000µl (CORNING)
− Tube ly tâm nhựa 15 ml (CORNING)
− Tube 0,2 ml, 0,5 ml, 1,5 ml (EPPENDOF)
− Strip (1 x 8 tube) 0,2 ml (ABI)
− Optical cap (ABI)
− Microplate (96 well, barcode) (ABI)
− Rack giữ lạnh (BIORAD)
− CryoTube 2ml (NUNC)
− Hộp đựng cryotube (NUNC)
− Bơm tiêm 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml (VIKIMCO)
− Quần áo bảo hộ (DANAMECO), khẩu trang, găng tay
2.1.2. Sinh phẩm – Hóa chất
− Plasmid mang gen mã hóa Taq polymerase được cung cấp bởi TS. Ferralli
ởĐại học Salisbury, Mỹ.
− QIAamp Viral RNA (QIAGEN)
~ 30 ~ − Iscript One-Step RT-PCR (BIORAD)
− Reverse transcriptase, AMV (ROCHE)
− Reverse transcriptase, eAMV (SIGMA)
− Reverse transcriptase, M-MLV (SIGMA)
− Tth DNA Polymerase (ROCHE)
− Transcriptor One-Step RT-PCR (ROCHE)
− Takara ExTaq (TAKARA)
− Primers and Probes H1N1 Set (INVITROGEN)
− SuperScript III RT Platinum One Step qRT-PCR System Kit (INVITROGEN)
− Primers virus cúm (PROLIGO, INVITROGEN)
− dNTP (SIGMA)
− RNA protector (SIGMA)
− TAE 10x (Tris base, Acetic Acid (Glacial), EDTA 0.5M pH 8.0)
− Thang DNA: 100bp (SIGMA), 500 bp (TAKARA)
− Agarose (PROMEGA)
− Bromophenol blue (SIGMA)
− IPTG (SIGMA)
− Ethidium bromide (PROMEGA)
− Ethanol 99% (MERCK)
− Máu gà 0,5%
− Nước cất pha tiêm (MEKOPHAR)
− Trehalose (SIGMA)
~ 31 ~ − Dextrose (SIGMA) − EDTA (SIGMA) − Mercapto (SIGMA) − Triton X-100 (SIGMA) − DTT (SIGMA) − Glycerol (SIGMA) − Tween 20 (SIGMA) − Nonidet P40 (ROCHE) − Acrylamide (SIGMA)
− N,N’-Methylene – bis – acrylamide (SIGMA)
− SDS (SIGMA) − Glycine (SIGMA) − Coomassie R250 (MERCK) − TEMED (SIGMA) − Lysozyme (SIGMA) − Bromophenol (SIGMA)
− Môi trường BHA (BioRad)
− Môi trường BHIA (BioRad)
~ 32 ~
2.2. Đối tượng nghiên cứu
− RNA chứng của virút cúm đại dịch A/H1N1-2009 được cung cấp bởi công ty Roche-Việt Nam và được bảo quản ở -20oC: dùng trong các thí nghiệm xác định số lượng bản sao RNA virút cúm A/H1N1-2009.
− 241 mẫu bệnh phẩm nghi nhiễm virút cúm A/H1N1-2009 được thu nhận tại Viện Pasteur TP.HCM: dùng trong nghiên cứu so sánh độ nhạy và độ đặc hiệu của các phương pháp.
− Các chủng virút cúm A/H5N1, A/H1N1 (cúm mùa), A/H3N2 và cúm B
được thu nhận và xác định đặc điểm tại Viện Pasteur TP.HCM: dùng trong khảo sát độ đặc hiệu của phương pháp RT-PCR
− Các chủng vi khuẩn gây bệnh đường hô hấp Streptococcus pneumoniae
(ATCC 46919), Haemophillus influenza (ATCC 10211), Escherichia coli (ATCC 35218), Klebsiella pneumoniae (ATCC 700603): dùng trong khảo sát độ đặc hiệu của phương pháp RT-PCR.
~ 33 ~