L ời mở đầu
3.1.2.1. Biểu hiện và tinh sạch Taq polymerase
Plasmid tái tổ hợp pTTQ18 mang đoạn gen mã hóa Taq polymerase (được hỗ trợ bởi TS. Ferralli, Đại học Salisbury) được biến nạp vào tế bào E.coli khả
nạp. Các khuẩn lạc trắng (20 khuẩn lạc) được chọn lọc và kiểm tra chủng mong
Hình 3.4. Kiểm tra độđặc hiệu của mồi
a: cặp mồi MA-12F và MA-225R b: cặp mồi H1-224F và H1-525R 1a: A/H1N1-2009; 2a: A/H1N1s; 3a: A/H3N2; 4a: A/H5N1; 5a: S. pneumoniae; 6a: K. pneumoniae; 7a: H. influenza; 8a: E. coli; 9a: cúm B
1b: S. pneumoniae; 2b: K. pneumoniae; 3b: H. influenza; 4b: E. coli; 5b: cúm B; 6b: A/H1N1-2009; 7b: A/H1N1s; 8b: A/H3N2; 9b: A/H5N1. M: thang 100bp a b 1 2 3 4 5 M 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 M
~ 53 ~
muốn (hình 3.5b). Kết quả khuếch đại đoạn gen mã hóa Taq polymerase từ
plasmid được tách chiết từ khuẩn lạc chọn lọc cho thấy kích thước tương tự kích thước mong muốn (~2,6kb) khi so với thang chuẩn (hình 3.5c). Đoạn gen mã hóa
được giải trình tự và có kết quả trùng khớp với trình tự gốc. Sau đó các khuẩn lạc này tiếp tục được tăng sinh và được kích thích hoặc không được kích thích bằng IPTG.
Sau khi tế bào được kích thích sản xuất, Taq polymearse được tinh sạch và bảo quản trong dung dịch đệm (Tris HCl 50mM pH 7,9; NaCl 100mM, DTT 0,5mM; triton X-100 1% và glycerol 50%) ở -20oC. Kết quả điện di 10µl sản
Hình 3.5. Kết quả biến nạp plasmid tái tổ hợp pTTQ18 vào E. Coli. a. Sơđồ plasmid pTTQ18
b. Khuẩn lạc của chủng mang plasmid được biến nạp
c. Kiểm tra khuẩn lạc được chọn: 1. thang 500bp; 2. plasmid được tách chiết; 3. Sản phẩm khuếch đại gen mã hóa Taq polymerase;M. Thang DNA
1 2 3 2,5kb 5,0kb c b a
~ 54 ~
phẩm tinh sạch từ nguồn được kích thích trên gel SDS-polyacrylamide (SDS- PAGE) xuất hiện vạch protein có kích thước bằng với kích thước protein chứng dương (Taq polymerase thương mại) khoảng 94kDa. Ngược lại sản phẩm tinh sạch từ nguồn không được kích thích không thấy xuất hiện vạch protein tương
ứng (hình 3.6). Như vậy chứng tỏ chủng vi khuẩn mang plasmid tái tổ hợp có khả năng tạo ra protein Taq polymerase khi được kích thích bằng IPTG.