L ời mở đầu
3.1.1.1. So sánh trình tự và thiết kế mồi
Thiết kế mồi nhằm mục đích đạt được sự cân bằng về tính đặc hiệu (specificity) và tính hiệu quả (efficiency) của phản ứng khuếch đại [44]. Hiện nay các phần mềm sinh học phân tử dùng để thiết kế mồi thường dựng sẵn các thông số chuẩn nhằm cân bằng giữa hai mục tiêu này. Các thông số cần được quan tâm trong thiết kế mồi khuếch đại là chiều dài mồi, vị trí nucleotide ở đầu cuối 3’, số
lượng GC và nhiệt độ tan chảy Tm (melting temperature) của mồi [2]. Tuy nhiên việc ứng dụng PCR trong chẩn đoán y khoa, các thông số và điều kiện phản ứng thường được điều chỉnh nhằm tăng chỉ số đặc hiệu để hạn chế đến mức tối thiểu kết quả dương tính giả [12].
Hình 3.1. Kết quả so sánh độ tương đồng các gen H, N và M trên NCBI
~ 50 ~
Các gen mã hóa protein M (gen M), mã hóa protein heamagglutinin (gen H) và mã hóa protein neuraminidase (gen N) của chủng virút cúm A/H1N1 gây
đại dịch tại khu vực phía nam Việt Nam được Viện Pasteur TP.HCM giải trình tự, phân tích và so sánh với các chủng virút cúm gây đại dịch trên thế giới. Kết quả cho thấy trình tự gen M, gen H và gen N của chủng virút cúm đại dịch tại Việt Nam có độ tương đồng 98% – 99% với các trình tự gen tương ứng của các chủng virút cúm gây đại dịch trên thế giới năm 2009 (hình 3.1)
Mồi dùng để phát hiện chuyên biệt gen M virút cúm A được thiết kế dựa chủ yếu vào vùng trình tự bảo tồn của gen này ở tất cả các thứ type của virút thuộc type A (hình 3.2a). Kết quả cặp mồi MA-12F và MA-225R đã được chọn
để phát hiện gen M của virút cúm trong nghiên cứu này (hình 3.3a).
Mồi dùng để phát hiện virút cúm A/H1N1 gây đại dịch năm 2009 được thiết kế tại vị trí có độ bảo tồn cao trên gen H1 của các chủng gây đại dịch tại
Hình 3.2. Trình tự gen M và gen H1 bảo tồn
a. Trình tự gen M bảo tồn của virút cúm A
b. Trình tự gen H1 bảo tồn của virút cúm A/H1N1/2009
a
~ 51 ~
Việt Nam và trên thế giới đồng thời không có khả năng phát hiện virút cúm mùa cùng thứ type H1N1 (hình 3.2b). Kết quả cặp mồi H1-224F và H1-525R được chọn sử dụng trong nghiên cứu này (hình 3.3b).