L ời mở đầu
2.3.14.3. Xử lý mẫu DNA vàn ạp mẫu vào máy giải trình tự
Chuyển sản phẩm đánh dấu vào eppendorf 1,5 ml. Bổ sung 5 μl hỗn hợp Stop Solution/Glycogen bao gồm 2μl Sodium Acetate 3M, 2μl Na2-EDTA 100mM, và 1μl Glycogen 20mg/ml, trộn đều. Cho 60μl Ethanol 95% (v/v) vào, vortex nhẹ, ly tâm 14.000rpm ở 4oC trong 15 phút. Cẩn thận hút bỏ dịch nổi, rửa 2 lần bằng 200 μl Ethanol 70%, ly tâm 14.000rpm ít nhất 2 phút ở 4oC. Hút bỏ
dịch nổi, làm khô cặn còn lại bằng máy ly tâm chân không trong 10 phút. Bổ
sung 40μl dung dịch Sample Loading Solution vào mỗi mẫu. Chuyển mẫu DNA vào các giếng trên plate thích hợp theo từng hàng, bổ sung một giọt dầu khoáng (mineral oil) lên bề mặt. Lập chương trình và chạy máy.
Hình 2.4. Nguyên tắc máy giải trình tự DNA tựđộng.
(1) Xilanh chứa gel polyacrylamide dùng để bơm gel polyacrylamide vào các ống mao dẫn. (2) Bình chứa dung dịch thải. (3) Phiến nhựa 96giếng chứa các mẫu cần phân tích trình tự DNA. Nạp mẫu vào phiến nhựa theo hàng ngang 8 giếng. (4) Hàng kim hút mẫu và dung dịch buffer đưa vào ống mao dẫn. (5) Hệ thống các ống mao dẫn. (6) Đèn laser đọc các trình tự DNA đã được gắn chất phát huỳnh quang. (7)Hệ thống nối với máy vi tính thu nhận dữ liệu.
~ 46 ~ FP TP TP PPV + = FN TP TP Pse + = FP TN TN Psp + = 2.3.15. Các phương pháp thống kê[1, 33] 2.3.15.1 Độ nhạy
Độ nhạy của một xét nghiệm chẩn đoán được định nghĩa là tỷ lệ người mang bệnh có kết quả xét nghiệm dương tính và được tính theo công thức sau:
Trong đó: Pse: độ nhạy; TP: số lượng dương tính thật (true positive); FN: số lương âm tính giả (false negative)
2.3.15.2. Độđặc hiệu
Độđặc hiệu của một xét nghiệm chẩn đoán được định nghĩa là tỷ lệ người không mang bệnh có kết quả xét nghiệm âm tính và được tính theo công thức sau:
Trong đó: Psp: độ đặc hiệu; TN: số lượng âm tính thật (true negative); FP: số lượng dương tính dương tính giả (false positive)
2.3.15.3. Giá trị tiên đoán dương
Giá trị tiên đoán dương (positive predictive value ~ PPV) được định nghĩa là tỷ lệ người có kết quả xét nghiệm dương tính thật sự mang bệnh và được tính theo công thức sau:
Trong đó: PPV: giá trị tiên đoán dương; TP: số lượng dương tính thật (true positive); FP: số lượng dương tính giả (false positive)
~ 47 ~ FN TN TN NPV + = 73 ) 05 , 0 ( 05 , 0 95 , 0 ) 96 , 1 ( ) 1 ( 2 2 2 2 = = − = + x x w P x xP Z FN TP α se se
2.3.15.4. Giá trị tiên đoán âm
Giá trị tiên đoán âm (negative predictive value ~ NPV) được định nghĩa là tỷ lệ người có kết quả xét nghiệm âm tính thật sự không mang bệnh và được tính theo công thức sau:
Trong đó: NPV: giá trị tiên đoán âm; TN: số lượng âm tính thật (true negative); FN: số lượng âm tính giả (false negative)
2.3.15.5. Ước tính cỡ mẫu cho phân tích độ nhạy và độ đặc hiệu
Cỡ mẫu được ước tính trong nghiên cứu giúp so sánh độ nhạy, độđặc hiệu của phương pháp RT-PCR do Viện Pasteur TP.HCM sản xuất so với phương pháp real-time RT-PCR (RRT-PCR) của CDC. Với hy vọng phương pháp RT- PCR sẽ đạt được độ nhạy và độđặc hiệu lần lượt vào khoảng 95% và 99% với số
chỉ số dao động trên dưới 5% so với phương pháp RRT-PCR và biết rằng tỷ lệ
mắc bệnh cúm H1N1-2009 trong quần thể được xét nghiệm tại Viện Pasteur TP.HCM vào khoảng 35% (số liệu Viện Pasteur TP.HCM), chúng tôi ước tính số
mẫu được thực hiện so sánh đểđạt độ tin cậy thống kê là 95% (α=0,05) như sau: Với số liệu trên, chúng ta có thể ước tính chỉ số TP + FN:
Trong đó: 2
α
Z là hằng số phân phối chuẩn; w là sai số của hai xác suất dương tính thật và âm tính thật.
Với tỷ lệ hiện hành ước tính của bệnh là 35%, số lượng cỡ mẫu cần thiết
~ 48 ~ 16 ) 05 , 0 ( 01 , 0 99 , 0 ) 96 , 1 ( ) 1 ( 2 2 2 2 = = − = + x x w P x xP Z TN FP α sp sp 208 35 , 0 73 = = + = dis se p FN TP n 25 65 , 0 16 ) 1 ( = = − + = dis sp P TN FP n
Trong đó: nse cỡ mẫu ước tính cho độ nhạy; Pdis là tỷ lệ lưu hành bệnh trong quần thể.
Tương tự có thể ước tính chỉ số FP+TN:
Do đó, số lượng cỡ mẫu cần thiết đểước tính độđặc hiệu là:
Trong đó: nsp là cỡ mẫu ước tính cho độđặc hiệu.
Trong trường hợp này, chúng ta có hai ước tính khá khác nhau. Do đó chúng tôi quyết định sẽ chọn cỡ mẫu ≥ 208 để có thể đạt được tỷ lệ độ nhạy mong muốn đồng thời sẽ khảo sát lại độ đặc hiệu của phương pháp trên cỡ mẫu lớn.
~ 49 ~
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Nghiên cứu xây dựng quy trình chế tạo kit xét nghiệm
3.1.1. Thiết kế mồi
3.1.1.1. So sánh trình tự và thiết kế mồi
Thiết kế mồi nhằm mục đích đạt được sự cân bằng về tính đặc hiệu (specificity) và tính hiệu quả (efficiency) của phản ứng khuếch đại [44]. Hiện nay các phần mềm sinh học phân tử dùng để thiết kế mồi thường dựng sẵn các thông số chuẩn nhằm cân bằng giữa hai mục tiêu này. Các thông số cần được quan tâm trong thiết kế mồi khuếch đại là chiều dài mồi, vị trí nucleotide ở đầu cuối 3’, số
lượng GC và nhiệt độ tan chảy Tm (melting temperature) của mồi [2]. Tuy nhiên việc ứng dụng PCR trong chẩn đoán y khoa, các thông số và điều kiện phản ứng thường được điều chỉnh nhằm tăng chỉ số đặc hiệu để hạn chế đến mức tối thiểu kết quả dương tính giả [12].
Hình 3.1. Kết quả so sánh độ tương đồng các gen H, N và M trên NCBI
~ 50 ~
Các gen mã hóa protein M (gen M), mã hóa protein heamagglutinin (gen H) và mã hóa protein neuraminidase (gen N) của chủng virút cúm A/H1N1 gây
đại dịch tại khu vực phía nam Việt Nam được Viện Pasteur TP.HCM giải trình tự, phân tích và so sánh với các chủng virút cúm gây đại dịch trên thế giới. Kết quả cho thấy trình tự gen M, gen H và gen N của chủng virút cúm đại dịch tại Việt Nam có độ tương đồng 98% – 99% với các trình tự gen tương ứng của các chủng virút cúm gây đại dịch trên thế giới năm 2009 (hình 3.1)
Mồi dùng để phát hiện chuyên biệt gen M virút cúm A được thiết kế dựa chủ yếu vào vùng trình tự bảo tồn của gen này ở tất cả các thứ type của virút thuộc type A (hình 3.2a). Kết quả cặp mồi MA-12F và MA-225R đã được chọn
để phát hiện gen M của virút cúm trong nghiên cứu này (hình 3.3a).
Mồi dùng để phát hiện virút cúm A/H1N1 gây đại dịch năm 2009 được thiết kế tại vị trí có độ bảo tồn cao trên gen H1 của các chủng gây đại dịch tại
Hình 3.2. Trình tự gen M và gen H1 bảo tồn
a. Trình tự gen M bảo tồn của virút cúm A
b. Trình tự gen H1 bảo tồn của virút cúm A/H1N1/2009
a
~ 51 ~
Việt Nam và trên thế giới đồng thời không có khả năng phát hiện virút cúm mùa cùng thứ type H1N1 (hình 3.2b). Kết quả cặp mồi H1-224F và H1-525R được chọn sử dụng trong nghiên cứu này (hình 3.3b).
3.1.1.2. Kiểm tra độ đặc hiệu của mồi được thiết kế
Để kiểm tra hiệu quả bắt cặp và độ đặc hiệu của hai cặp mồi được thiết kế, chúng tôi tiến hành chạy phản ứng khuếch đại sử dụng từng cặp mồi riêng rẽ với một số tác nhân vi khuẩn và virút có khả năng gây bệnh qua đường hô hấp. Các vi khuẩn được khảo sát là vi khuẩn Streptococcus pneumoniae, Klebsiella pneumoniae, Haemophillus influenza và Escherichia coli. Virút được khảo sát là các virút cúm mùa A/H1N1 (A/H1N1s), A/H3N2, A/H5N1, virút cúm B và virút cúm đại dịch 2009 A/H1N1.
Kết quả cho thấy đối với cặp mồi MA-12F và MA-225R có khả năng phát hiện được các virút cúm type A (virút cúm A/H1N1s, A/H3N2, A/H5N1), không khả năng phát hiện virút cúm B và các vi khuẩn trong nghiên cứu (hình 3.4a). Gen M là một trong 2 gen được sử dụng để phân biệt các thứ type virút cúm [51] do đó việc cặp mồi MA-12F và MA-225R được thiết kế dựa trên trình tự bảo tồn gen M của tất cả các virút cúm type A nên chỉ có thể phát hiện các virút cúm
Hình 3.3: Các mồi được thiết kếđể phát hiện virút cúm A/H1N1-2009
a. mồi phát hiện gen M; b. mồi phát hiện gen H1 virút đại dịch 2009
~ 52 ~
thuộc type này và không thể phát hiện các virút cúm thuộc các type khác như
type B và C.
Trong khi đó, kết quả cho thấy cặp mồi H1-224F và H1-525R chỉ có khả
năng phát hiện virút cúm đại dịch A/H1N1-2009 và không phát hiện các chủng virút cúm khác cùng type (virút cúm A/H1N1s, H/H3N2, A/H5N1) và khác type (cúm B) cũng như các vi khuẩn trong nghiên cứu (hình 3.4b).
3.1.2. Điều chế enzyme Taq polymerase
3.1.2.1. Biểu hiện và tinh sạch Taq polymerase
Plasmid tái tổ hợp pTTQ18 mang đoạn gen mã hóa Taq polymerase (được hỗ trợ bởi TS. Ferralli, Đại học Salisbury) được biến nạp vào tế bào E.coli khả
nạp. Các khuẩn lạc trắng (20 khuẩn lạc) được chọn lọc và kiểm tra chủng mong
Hình 3.4. Kiểm tra độđặc hiệu của mồi
a: cặp mồi MA-12F và MA-225R b: cặp mồi H1-224F và H1-525R 1a: A/H1N1-2009; 2a: A/H1N1s; 3a: A/H3N2; 4a: A/H5N1; 5a: S. pneumoniae; 6a: K. pneumoniae; 7a: H. influenza; 8a: E. coli; 9a: cúm B
1b: S. pneumoniae; 2b: K. pneumoniae; 3b: H. influenza; 4b: E. coli; 5b: cúm B; 6b: A/H1N1-2009; 7b: A/H1N1s; 8b: A/H3N2; 9b: A/H5N1. M: thang 100bp a b 1 2 3 4 5 M 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 M
~ 53 ~
muốn (hình 3.5b). Kết quả khuếch đại đoạn gen mã hóa Taq polymerase từ
plasmid được tách chiết từ khuẩn lạc chọn lọc cho thấy kích thước tương tự kích thước mong muốn (~2,6kb) khi so với thang chuẩn (hình 3.5c). Đoạn gen mã hóa
được giải trình tự và có kết quả trùng khớp với trình tự gốc. Sau đó các khuẩn lạc này tiếp tục được tăng sinh và được kích thích hoặc không được kích thích bằng IPTG.
Sau khi tế bào được kích thích sản xuất, Taq polymearse được tinh sạch và bảo quản trong dung dịch đệm (Tris HCl 50mM pH 7,9; NaCl 100mM, DTT 0,5mM; triton X-100 1% và glycerol 50%) ở -20oC. Kết quả điện di 10µl sản
Hình 3.5. Kết quả biến nạp plasmid tái tổ hợp pTTQ18 vào E. Coli. a. Sơđồ plasmid pTTQ18
b. Khuẩn lạc của chủng mang plasmid được biến nạp
c. Kiểm tra khuẩn lạc được chọn: 1. thang 500bp; 2. plasmid được tách chiết; 3. Sản phẩm khuếch đại gen mã hóa Taq polymerase;M. Thang DNA
1 2 3 2,5kb 5,0kb c b a
~ 54 ~
phẩm tinh sạch từ nguồn được kích thích trên gel SDS-polyacrylamide (SDS- PAGE) xuất hiện vạch protein có kích thước bằng với kích thước protein chứng dương (Taq polymerase thương mại) khoảng 94kDa. Ngược lại sản phẩm tinh sạch từ nguồn không được kích thích không thấy xuất hiện vạch protein tương
ứng (hình 3.6). Như vậy chứng tỏ chủng vi khuẩn mang plasmid tái tổ hợp có khả năng tạo ra protein Taq polymerase khi được kích thích bằng IPTG.
3.1.2.2. Hoạt tính Taq polymerase
Để đánh giá hoạt tính enzyme, chúng tiến hành so sánh sản phẩm Taq
polymerase được tinh sạch với enzyme Taq polymerase thương mại bằng cách kiểm tra cùng sản phẩm khuếch đại.
Hình 3.6. Kết quả phân tích SDS-PAGE
Taq polymerase.
1. chứng dương Taq polymerase thương mại 5U; 2. 10µl sản phẩm tinh sạch từ
nguồn được kích thích; 3. 10µl sản phẩm tinh sạch từ nguồn không được kích thích; M. Marker protein 1 2 3 M 116kDa 90kDa Hình 3.7. Kết quả kiểm tra hoạt tính enzyme.
1. 1µl Taq polymerase tinh sạch 2. 0,5µl Taq polymerase tinh sạch 3. 0,1µl Taq polymerase tinh sạch 4. 2U Taq polymerase thương mại M. Marker DNA
~ 55 ~
Kết quả khuếch đại cho thấy 1µl sản phẩm tinh sạch chứa hoạt tính Taq polymerase tương đương với 2U Taq polymerase thương mại (hình 3.7). Với kết quả này, nồng độ hoạt tính của sản phẩm enzyme polymerase tinh sạch vào khoảng 2U/µl. Trong 200ml dung dịch nuôi cấy, chúng tôi thu được 10ml dung dịch enzyme tinh sạch với nồng độ hoạt tính 2U/µl, như vậy năng suất tạo enzyme là 500.000U/lít dịch nuôi cấy. Kết quả này tương tự kết quả sản xuất
Taq polymerase của Leelayuwat năm 1997 [27]. Trong nghiên cứu của Pluthero
đã sản xuất được 1.000.000U/lít dịch nuôi cấy ban đầu [40].
Toàn bộ quy trình biểu hiện và tinh sạch Taq polymerase trong nghiên cứu này được thực hiện theo quy trình đã được dựng sẵn của TS. Ferralli, đại học Salisbury (Mỹ).
3.1.3. Khảo sát hỗn hợp enzyme phản ứng RT-PCR
Phản ứng khuếch đại chuỗi kết hợp phiên mã ngược (RT-PCR) là phản
ứng sử dụng bản mẫu ban đầu (mạch khuôn) là các phân tử RNA (thay vì phân tử DNA như phản ứng khuếch đại chuỗi PCR thông thường). Như vậy để thực hiện được bước khuếch đại chuỗi, các RNA phải được chuyển thành các cDNA (complementary DNA) bằng enzyme phiên mã ngược reverse transcriptase. Từ
các cDNA mới tạo thành, enzyme DNA polymerase sẽ thực hiện chức năng khuếch đại chuỗi, khuếch đại đoạn DNA mong muốn .
Hai giai đoạn phiên mã ngược và khuếch đại chuỗi có thể được thực hiện trong hai phản ứng đơn khác nhau (sử dụng hai tube phản ứng). Quá trình thực hiện RT-PCR theo hai bước tốn nhiều thời gian và công sức thực hiện. Ngày nay các nhà khoa học đã thực hiện việc kết hợp 2 enzyme reverse transcriptase và DNA polymerase để tạo nên hỗn hợp enzyme nhằm thực hiện phản ứng RT-PCR
~ 56 ~
chỉ trong một tube phản ứng. Các hỗn hợp enzyme này đã được thương mại hóa. Ngoài ra có một số enzyme có thể thực hiện cả 2 chức năng reverse transcriptase và polymerase như enzyme Tth DNA polymerase.
Trong nghiên cứu này chúng tôi thực hiện việc thử nghiệm tạo một số hỗn hợp enzyme revserse transcriptase và DNA polymerase nhằm tìm ra hỗn hợp cho kết quả khuyếch đại tối ưu, đồng thời so sánh với các hỗn hợp enzyme được thương mại trên thị trường hiện nay. Qua quá trình khảo sát chúng tôi đã tìm
được hỗn hợp hai enzyme có thể trộn chung với nhau (hỗn hợp 5) và cho kết quả
khuếch đại tốt hơn các hỗn hợp enzyme khác cùng thí nghiệm (hình 3.8). Hỗn hợp 5 bao gồm enzyme reverse transcriptase của hãng Sigma (eAMV-RT) và enzyme Taq polymerase được tạo ra ở trên.
Từ kết quả ban đầu đạt được của hỗn hợp enzyme trên, chúng tôi tiến hành khảo sát thành phần tỷ lệ các enzyme trong hỗn hợp để tìm ra tỷ lệ thích hợp nhất. Tỷ lệ DNA polymerase/reverse transcriptase (U/U) được khảo sát là 0,5; 1; 1,5; 2 và 4. Kết quả cho thấy với tỷ lệ 2,0 (đơn vị DNA polymeasre/đơn vị
reverse transcriptase), hỗn hợp enzyme cho kết quả phiên mã ngược và khuếch
đại chuỗi hiệu quả hơn các tỷ lệ khác (hình 3.9).
Hình 3.8. So sánh hỗn hợp enzyme RT-PCR
1. Hỗn hợp 1; hỗn hợp 2; hỗn hợp 3 4. hỗn hợp 4; 5. hỗn hợp 5.
~ 57 ~
Ngoài hỗn hợp enzyme, các thành phần khác của phản ứng cũng ảnh hưởng đến kết quả của phản ứng RT-PCR, đặc biệt là thành phần đệm (buffer). Qua quá trình khảo sát chúng tôi ghi nhận với thành phần đệm bao gồm Tris-HCl 10mM (pH 8,3); KCl 100mM, (NH4)2SO4 15mM và MgCl2 3mM cho kết quả
phản ứng RT-PCR ổn định. Ngoài ra trong phản ứng sử dụng RNA làm khuôn mẫu cần phải bổ sung chất ức chế enzyme Rnase để đảm bảo mạch khuôn RNA không bị phân hủy.
Như vậy chúng tôi đã xác định các thành phần cần thiết để thực hiện phản
ứng RT-PCR bằng hỗn hợp nghiên cứu (được đặt tên là pMIX RT-PCR). Tiếp theo hỗn hợp này được thực hiện so sánh với các hỗn hợp (kit) thương mại được bán trên thị trường.
1 2 3 4 5 Hình 3.9. Khảo sát tỷ lệ thành phần hỗn hợp enzyme
1. tỷ lệ 0,5; 2. tỷ lệ 1,0; 3. tỷ lệ
~ 58 ~
Kết quả so sánh các hỗn hợp enzyme cho thấy hỗn hợp pMIX RT-PCR cho hiệu quả khuếch đại tương hỗn hợp enzyme thương mại Transcriptor RT-PCR