L ời mở đầu
3.3.3. Kết quả triển khai thực tế tại TTYTDP các tỉnh phía Nam
Trước khi tiến hành việc triển khai thực tế bộ kit pFLU tại các TTYTDP, chúng tôi tiến hành đánh giá năng lực phòng xét cúm tại các Trung tâm này. Trung tâm nào đạt các chỉ tiêu an toàn cũng như trang thiết bị phù hợp theo tiêu chuẩn của Bộ Y tế đề ra sẽ được triển khai thực tế sử dụng bộ kit pFLU trong xét nghiệm cúm.
~ 93 ~
Tại TTYTDP An Giang: xác định được 100% mẫu âm, dương với virus
cúm A/H1N1-2009
~ 94 ~
Tại TTYTDP Bạc Liêu: xác định được 100% mẫu âm, dương với virus
cúm A/H1N1-2009
\
~ 95 ~
Tại TTYTDP Bến Tre: xác định được 100% mẫu âm, dương với virus
cúm A/H1N1-2009
~ 96 ~
Tại TTYTDP Đà Lạt: xác định được 100% mẫu âm, dương với virus cúm
A/H1N1-2009
~ 97 ~
Tại TTYTDP Đồng Nai: xác định được 100% mẫu âm, dương với virus
cúm A/H1N1-2009
~ 98 ~
Tại TTYTDP Đồng Tháp: xác định được 100% mẫu âm, dương với virus
cúm A/H1N1-2009
~ 99 ~
Phần 4
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
4.1. Kết luận
1. Sản xuất thành công enzyme polymerase với nồng độ hoạt tính là 2U/µl.
2. Thiết kế hai cặp mồi đặc hiệu cho virút cúm A (MA-12F và MA-225R) và virút cúm đại dịch A/H1N1 tại Việt Nam (H1-224F và H1-525R). 3. Xây dựng thành công chứng nội cho phản ứng RT-PCR sử dụng cùng
cặp mồi phát hiện đoạn gen phát hiện virút cúm A trên gen M.
4. Chuẩn hóa thành công điều kiện phản ứng RT-PCR đơn cho từng cặp mồi.
Cặp mồi MA-12F và MA-225R
- Nhiệt độ phản ứng phiên mã ngược là 50oC; nhiệt độ bắt cặp khuếch đại chuỗi khoảng 50oC – 55oC
- Nồng độ mồi: 0,4µM
- Nồng độ Mg2+: 2,5mM – 4mM
- Nồng độ dNTP: 0,4mM
- Thời gian phiên mã ngược khoảng 10 phút – 30 phút; thời gian biến tính 30 giây – 1 phút; thời gian kéo dài 1 phút; thời gian kết thúc 10 phút.
Cặp mồi H1-224F và H1-525R
- Nhiệt độ phản ứng phiên mã ngược khoảng 45oC – 50oC; nhiệt độ bắt cặp khuếch đại chuỗi khoảng 50oC – 53oC
- Nồng độ mồi: 0,8µM
- Nồng độ Mg2+: 3,5mM – 4mM
~ 100 ~
- Thời gian phiên mã ngược khoảng 15 phút – 30 phút; thời gian biến tính 30 giây – 1 phút; thời gian kéo dài 30 giây – 1 phút; thời gian kết thúc 10 phút.
5. Chuẩn hóa thành công phản ứng multplex RT-PCR
- Nhiệt độ phản ứng phiên mã ngược khoảng 45oC; nhiệt độ bắt cặp khuếch đại chuỗi khoảng 50oC
- Nồng độ mồi trong phản ứng có chứng nội: cặp mồi MA-12F và MA-225R là 0,6µM; cặp mồi H1-224F và H1-525R là 0,8µM
- Nồng độ Mg2+: 4mM – 5mM
- Nồng độ dNTP: 0,6mM
- Thời gian phiên mã ngược khoảng 15 phút – 30 phút; thời gian biến tính 30 giây – 1 phút; thời gian kéo dài 30 giây – 1 phút; thời gian kết thúc 5 phút – 10 phút.
6. Xây dựng thành công qui trình phát hiện virút cúm A và virút cúm đại dịch A/H1N1 2009 bằng multiplex RT-PCR với các thông số sau: - Giới hạn phát hiện: 125 bản sao bộ gen virút cúm
- Độ nhạy 95% so với phương pháp real time RT-PCR của CDC
- Độc đặc hiệu: 100%
- Giá trị tiên đoán dương: 100%
- Giá trị tiên đoán âm: 98,3%
- Độ lặp lại: 100%
7. Đã xây dựng và khảo sát điều kiện bảo quản hỗn hợp phản ứng và chứng dương
8. Tiêu chuẩn cơ sở cho chẩn đoán cúm A/H1N1 đại dịch 2009 bằng RT- PCR đã được xây dựng
9. Xây dựng thành công qui trình xét nghiệm chẩn đoán cúm A/H1N1 đại dịch 2009 bằng RT-PCR
~ 101 ~
10. Bộ kit thành phẩm từ đề tài đã được kiểm định chứng nhận của Viện kiểm định Quốc gia Vắcxin-Sinh phẩm y tế
11. Đã triển khai thành công việc sử dụng bộ kit thành phẩm tại các TTYTDP khu vực phía Nam.
4.2. Đề nghị
¾ Tiếp tục khảo sát điều kiện bảo quản hỗn hợp trong khoảng thời gian dài hơn;
¾ Tiếp tục giám sát sự biến đổi của virút cúm nói chung và virút cúm đại dịch 2009 A/H1N1 nói riêng để có thể kịp thời thay đổi các mồi phát hiện phù hợp trong chẩn đoán;
¾ Có thể phát triển hỗn hợp phản ứng multiplex RT-PCR phát hiện nhiều chủng cúm cùng một lúc như cúm A/H5N1, A/H3N2, cúm B…
~ 102 ~
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Akobeng, A. K. 2006. Understanding diagnostic test 1: sensitivity, specificity and predictive values. Acta pǽdiatrica. 96:338 – 341.
2. Adb-Elsalam, K. A. 2003. Bioinformatic tools and guideline for PCR primer design. African journal of biotechnology. 2: 91 – 95.
3. Barbas III, C. F., D. R. Burton, J. K. Scott, and G. J. Silverman. 2001. General Procedures: quantitation of DNA and RNA. In Phage display: a laboratory manual. Cold spring harbor laboratory press. A3.9. 4. Beckman Coulter. 2000. CEQ Dye Terminator Cycle Sequencing with
Quick Start Kit.
(http://www.lsbi.mafes.msstate.edu/CEQ_Website/CEQ_TngWkshop_De c2003/CEQuencing/SeqProtocol_qs.pdf)
5. CDC. 2009a. Interim recommendations for clinical use of influenza diagnostic tests during the 2009-10 influenza season.
(http://www.cdc.gov/h1n1flu/guidance/diagnostic_tests.htm)
6. CDC. 2009b. Interim guidance for the detection of novel influenza A virus using rapid influenza diagnostic tests.
(http://www.cdc.gov/h1n1flu/guidance/rapid_testing.htm)
7. Chang, L. Y., S. R. Shih, P. L. Shao, D. T. N. Huang, and L. M. Huang. 2009. Novel swine – origin influenza virus A (H1N1): The first pandemic of the 21th century. J Formos Med Assoc. 108: 526 – 532. 8. Chen, W., P. A. Calvo, D. Malide, J. Gibbs, U. Schubert, I. Bacik, S.
Basta, R. O’neil, J. Schickli, P. Palese, P. Henklein, J. R. Bennink, and J. W. Yewdell. 2001. A novel influenza A virus mitochondrial protein that induces cell death. Nature Med. 7: 1306–1312.
9. Cheng, P. K., K. K. Wong, A. H. Wong, A. Y. Ng, S. Y. Chow, R. K. Lam, C. S. Lau, K. C. Ng, and W. Lim. 2010. Performance of
~ 103 ~
laboratory diagnostics for the detection of influenza A(H1N1)v virus as correlated with the time after symptom onset and viral load. Clinical and diagnostic virology. 47: 182 – 185.
10. Chien, L-J., T-L. Liao, P-Y. Sun, J-H. Huang, D. J. Gubler, and G-J. J. Chang. 2006. Development of real-time reverse transcriptase PCR assay to detect and serotype dengue viruses. Journal of clinical microbiology.44: 1925 – 1304.
11. Conenello, G. M., D. Zamarin, L. A. Perrone, T. Tumpey, and P. Palese. 2007. A single mutation in the PB1–F2 of H5N1 (HK/97) and 1918 influenzaAviruses contributes to increased virulence. PLoS Pathog. 3: e141.
12. Dieffenbach, C. W., T. M. Lowe, and G. S. Dveksler. 1993. General concepts for PCR primer design. Genome research. 3: S30 – S37.
13. Faix, D. J., S. S. Sherman, and S. H. Waterman. 2009. Rapid-Test Sensitivity for Novel Swine-Origin Influenza A (H1N1) Virus in Humans. N Engl J Med. 361: 728 – 729.
14. Gabriel, G., A. Herwig, and H. D. Klenk. 2008. Interaction of polymerase subunit PB2 and NP with importin a1 is a determinant of host range of influenza A virus. PloS Pathog. 4: e11.
15. Gunson, R., A. Maclean, E. Davies, S. Bennett, R. Miller, and W. Carman. 2010. Development of a multiplex real-time RT-PCR that allows universal detection of influenza A viruses and simultaneous typing of influenza A/H1N1/2009 virus. Journal of Virological Methods.
163: 258-261.
16. Grunenwald, H. 2002. Optimization of polymerase chain reactions, in: PCR protocol (edited by J. M. S. Bartlett, and D. Stirling). Humana press. 226: 89 – 97.
~ 104 ~
17. Hatta, M., P. Gao, P. Halfmann, and Y. Kawaoka. 2001. Molecular basis for high virulence of Hong Kong H5N1 influenza A viruses.
Science. 293: 1840 – 1842.
18. Hawkes, M., S. E. Richardson, M. Ipp, S. Schuh, D. Adachi, and D. Tran. 2010. Sensitivity of Rapid Influenza Diagnostic Testing for Swine-Origin 2009 A (H1N1) Influenza Virus in Children.
PEDIATRICS.125: e639 – e644.
19. Imai, Y., K. Kuba, G. G. Neely, R. Yaghubian-Malhami, T. Perkmann, G. van Loo, M. Ermolaeva, R. Veldhuizen, Y. H. Leung, H. Wang, H. Liu, Y. Sun, M. Pasparakis, M. Kopf, C. Mech, S. Bavari, J. S. Peiris, A. S. Slutsky, S. Akira, M. Hultqvist, R. Holmdahl, J. Nicholls, C. Jiang, C. J. Binder, and J. M. Penninger. 2008. Identification of oxidative stress and Toll-like receptor 4 signaling as a key pathway of acute lung injury. Cell. 133: 235 – 249.
20. Invitrogen. 2004. TA Cloning® Kit with One Shot Chemically Competent E. coli.
(http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/ta_man.pdf)
21. Jackson, D., M. J. Hossain, D. Hickman, D. R. Perez, and R. A. Lamb. 2008. A new influenza virus virulence determinant: the NS1 protein four C-terminal residues modulate pathogenicity. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 105: 4381 – 4386.
22. Kash, J. C., T. M. Tumpey, S. C. Proll, V. Carter, O. Perwitasari, M. J. Thomas, C. F. Basler, P. Palese, J. K. Taubenberger, A. Garcia-Sastre, D. E. Swayne, and M. G. Katza. 2006. Genomic analysis of increased host immune and cell death responses induced by 1918 influenza virus. Nature
~ 105 ~
23. Kawaoka, Y., S. Krauss, and R. G. Webster. 1989. Avian-to-human transmission of the PB1 gene of influenza A viruses in the 1957 and 1968 pandemics. J. Virol. 63: 4603 – 4608.
24. Kobasa, D., S. M. Jones, K. Shinya, J. C. Kash, J. Copps, H. Ebihara, Y. Hatta, J. H. Kim, P. Halfmann, M. Hatta, F. Feldmann, J. B. Alimonti, L. Fernando, Y. Li, M. G. Katze, H. Feilmann, and Y. Kawaoka. 2007. Aberrant innate immune response in lethal infection of macaques with the 1918 influenza virus. Nature. 445: 319 – 323.
25. Lalle, E., L. Bordi, C. Castilletti, S. Meschi, M. Selleri, F. Carletti, D. Lapa, D. Travaglini, G. Ippolito, M. R. Capobianchi, and A. D. Caro. 2010. Design and clinical application of a molecular method for detection and typing of the influenza A/H1N1pdm virus. Journal of virology methods. 163: 486 – 488.
26. Lamb, R. A. and R. M. Krug. 2001. Orthomyxoviridae: the viruses and their replication, p. 1487-1531. In D. M. Knipe and P. M. Howley (ed.), Fields virology, 4th ed. Lippincott, Williams, and Wilkins, Philadelphia, Pa.
27. Leeluyawat, C., T. Srisuk, R. Paechaiyaphum, T. Limpaipoon, A. Romphruk, and A. Romphruk. 1997. Production and evaluation of Taq DNA polymerase. Journal of the Medical Association of Thailand. Suppl 1: S129 – S137.
28. Massin, P., S. van der Werf, and N. Naffakh. 2001. Residue 627 of PB2 is a determinant of cold sensitivity in RNA replication of avian influenza viruses. J. Virol. 75: 5398 – 5404.
29. Markoulatos, P., N. Siafakas, and M. moncany. 2002. Multiplex polymerase reaction: a practical approach. Journal of clinical laboratory analysis.16: 47 – 51.
~ 106 ~
30. McAuley, J. L., F. Hornung, K. L. Boyd, A. M. Smith, R. McKeon, J. Bennink, J. W. Yewdell, and J. A. McCullers. 2007. Expression of the 1918 influenza A virus PB1–F2 enhances the pathogenesis of viral and secondary bacterial pneumonia. Cell Host Microbe. 2: 240 – 249.
31. Mehle, A., and J. A. Doudna. 2008. An inhibitory activity in human cells restricts the function of an avian-like influenza virus polymerase.
Cell Host Microbe. 4: 111 – 122.
32. Morens, D. M., J. K. Taubenberger, and A. S. Fauci. 2009. The persistent legacy of the 1918 influenza virus. N. Engl. J. Med. 361: 225 – 229.
33. Nancy, M., and M. S. F. Buderer. 1996. Statistical methodology: I. Incorporating the prevalence of disease into the sample size calculation for sensitivity and specificity. Academic emergency medicine. 3: 895 – 900.
34. Neumann, G., T. Noda, And Y. Kawaoka. 2009. Emergence and pandemic potential of swine-origin H1N1 influenza virus. Nature. 459: 931 – 939.
35. Nguyễn Hoàng Lộc, Lê Việt Dũng, Trần Quốc Dung. 2008. Giáo trình: công nghệ DNA tái tổ hợp. NXB Đại học Quốc gia TP.HCM.
36. Novel Swine-Origin Influenza A (H1N1) Virus Investigation Team.
2009. Emergence of a Novel Swine-Origin Influenza A (H1N1) Virus in Humans. N Engl J Med.360: 2605 – 2615.
37. O'Neill, R. E., J. Talon, and P. Palese. 1998. The influenza virus NEP (NS2 protein) mediates the nuclear export of viral ribonucleoproteins.
EMBO J. 17: 288 – 296.
38. Panning, M., M. Erickmann, O. Landt, M. Monazahian, S.
~ 107 ~
Gunther, B. Hollmann, D. Huzly, J. F. Drexler, A. Helmer, S. Becker, B. Matz, A. M. Eis-Hubinger, and C. Droster. 2009. Detection of influenza A(H1N1)v virus by real-time RT-PCR.
Eurosurveillance. 14: 1 – 6.
39. Pichlmair, A., O. Schlz, C. P. Tan, T. I. Naslund, P. Liljestrom, F. Weber, and C. R. e Sousa. 2006. RIG-I-mediated antiviral responses to single-stranded RNA bearing 59-phosphates. Science. 314: 997 – 1001. 40. Pluthero, F. G. 1993. Rapid purification of high activity Taq DNA
polymerase. Nucleic acid research. 21: 4850 – 4851. 41. Qiagen. 2007. QIAamp® Viral RNA Mini Handbook
(http://www1.qiagen.com/literature/render.aspx?id=366&tp=4)
42. Rameix-Welti, M. A., A. Tomoiu, E. D. S. Afonso, S. van der Werf, and N. Naffakh. 2009. Avian influenza A virus polymerase association with nucleoprotein, but not polymerase assembly, is impaired in human cells during the course of infection. J. Virol. 83: 1320 – 1331.
43. Rychlik, W., W. J. Spencer, and R. E. Rhoads. 1990. Optimization of the annealing temperature for DNA amplification in vitro. Nucleic acids research.18: 6409 – 6412.
44. Sachse, K. 2003. Specificity and performance of diagnostic PCR assay in: PCR detection of microbial pathogens (edited by K. Sachse and J. Frey). Humana press. 216:12 – 14.
45. Seo, S., E. Hoffmann, and R. G. Webster. 2002. Lethal H5N1 influenza viruses escape host anti-viral cytokine responses. Nature Med.
8: 950 – 954.
46. Steel, J., A. C. Lowen, S. Mubareka, and P. Palese. 2009. Transmission of influenza virus in a mammalian host is increased by PB2 amino acids 627K or 627E/701N. PloS Pathog. 5: e1000252.
~ 108 ~
47. Stevens, J., A. L. Corper, C. F. Basler, J. K. Taubenberger, P. Palese, and I. A. Wilson. 2004. Structure of the uncleaved human H1 hemagglutinin from the extinct 1918 influenza virus. Science. 303:1866– 1870.
48. Tan, S. S., and J. H. Weis. 1992. Development of a sensitive reverse transcriptase PCR assay, RT-RPCR, utilizing rapid cycles times. Genome research.2: 137 – 143.
49. The TDR diagnostics evaluation expert panel. 2008. Evaluation of diagnostic tests for infectious diseases: general principles. Nature. S16 – S28.
50. Van Hoeven, N., C. Pappas, J. A. Belser, T. R. Maines, H. Zeng, A. Garcia-Sastre, R. Sasisekharan, J. M. Katz, and T. M. Tumpey.
2009. Human HA and polymerase subunit PB2 proteins confertransmission of an avian influenza virus through the air. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 106: 336 – 337.
51. Webster, R. G., W. J. Bean, O. T. Gorman, T. M. Chambers, and Y. Kawaoka. 1992. Evolution and ecology of influenza A viruses.
Microbiological reviews.56: 152 – 179.
52. Wilson, I. G. 1997. Inhibition and facilitation of nucleic acid amplification. Appl. Environ. Microbiol. 63: 3741 – 3751.
53. WHO. 2002. Manual on animal influenza diagnosis and surveillance.
(http://www.who.int/csr/resources/publications/influenza/en/whocdscsrn cs20025rev.pdf)
54. WHO. 2009. Information for laboratory diagnosis of pandemic (H1N1) 2009 virus in humans-revised.
(http://www.who.int/csr/resources/publications/swineflu/WHO_Diagnost ic_RecommendationsH1N1_20090521.pdf)
~ 109 ~
55. WHO. 2009. WHO ad hoc scientific teleconference on the current influenza A (H1N1) situation 29 April 2009. 1 – 6.
(http://www.who.int/csr/resources/publications/swineflu/TCReport2009_ 05_04.pdf)
56. Yiyue, G., L. Cui, X. Qi, J. Shan, Y. Shan, Y. Qi, B. Wu, H. Wang, and Z. Shi. 2010. Detection of novel swine origin influenza A virus (H1N1) by real-time nucleic acid sequence-based amplification. Journal of Virological Methods. 163: 495-497.
PHỤ LỤC 1
KIỂM TRA ĐỘỔN ĐỊNH KIT PFLU SAU 6 THÁNG BẢO QUẢN
Kết quả kiểm tra ngay khi sản xuất
Lô: 0610
NSX: 08.04.2010
Ngày Thực hiện: 08.04.2010
Người Thực hiện: Ngô Chung Chỉnh
Số mẫu: 1 mẫu dương H1N1 2009, 1 mẫu dương H5N1, 1 mẫu âm +H5N1 +H1N1 - M 1
Kết quả kiểm tra sau 6 tháng bảo quản
Lô: 0610
NSX: 08.04.2010
Ngày Thực hiện: 08.10.2010
Người Thực hiện: Ngô Chung Chỉnh Số mẫu: 6 mẫu dương, 1 mẫu âm M + + + + + + - 2