L ời mở đầu
3.1.5.1. Quy trình tạo chứng nội
Trong nghiên cứu này chúng tôi cũng tiến hành xây dựng chứng nội cho phản ứng RT-PCR phát hiện virút cúm A nói chung và virút cúm A/H1N1 đại dịch nói riêng. Nhằm giảm thiểu số lượng mồi được sử dụng trong phản ứng multiplex RT-PCR, chúng tôi tận dụng cặp mồi MA-12F và MA-225R vừa có thể khuếch đại đoạn trình tự gen M vừa có thể khuếch đại chứng nội nhưng vẫn
~ 74 ~
Do đó chứng nội được thiết kế có trình tự hai đầu tương tự trình tự bắt cặp của hai mồi MA-12F và MA-225R, nhưng trình tự giữa được cắt ngắn một đoạn khoảng 100bp so với trình tự để phát hiện gen M. Như vậy, sau khi khuếch đại trình tự chứng nội có chiều dài ngắn hơn trình tự phát hiện gen M khoảng 100bp và có thể được phân biệt trên gel agarose.
Kết quả tạo chứng nội chi tiết:
• Sử dụng 2 cặp mồi MA-12F - M89R và M176F - MA-225R để khuếch
đại hai đoạn gen MA1 và MA2 (hình 3.25);
• Sau đó cắt nối hai đoạn MA1 và MA2 lại với nhau và đặt tên là IC; IC sau
đó đượcdòng hóa vào vector pCR2.1 và được biến nạp vào tế bào khả nạp
E.coli (hình 3.26).
1 2 3 M Hình 3.25. Kết quả khuếch đại MA1-MA2 1. MA1; 2. MA2; 3. MA; M. thang 100bp
Hình 3.26. Kết quả biến nạp vector tái tổ
~ 75 ~
• Các khuẩn lạc trắng mọc trên môi trường kháng sinh được chọn lọc và tách plasmid (hình 3.27).
• Các plasmid được kiểm tra xem có mang đúng trình tự IC mong muốn không bằng cách thực hiện PCR với cặp mồi MA-12F và MA-225R (chiều dài dự kiến đạt được là 150bp). Kết quả cho thấy các plasmid thử nghiệm
điều mang đúng trình tự có kích thước mong muốn của IC (hình 3.28)
Từ kết quả trên cho thấy, chúng tôi đã tạo ra được plasmid mang trình tự
acid nucleic mong muốn để làm chứng nội. Bước tiếp theo là khảo sát nồng độ
chứng nội được bổ sung vào mỗi phản ứng RT-PCR sao cho không gây ảnh hưởng đến kết quả khuếch đại các gen mục tiêu nếu có.
Hình 3.28. Kết quả kiểm tra IC chèn vào plasmid bằng PCR
IC1 IC2 IC3 IC4 IC5 IC6 M
Hình 3.27. Kết quả khuẩn lạc được tách plasmid
~ 76 ~
3.1.5.2. Khảo sát nồng độ chứng nội tối thiểu cho phản ứng RT-PCR
Nồng độ plasmid chứng nội được khảo sát trong phản ứng RT-PCR là 150pg/µl; 15pg/µl; 1,5pg/µl, 150fg/µl và 15fg/µl. Kết quả cho thấy nồng độ
chứng nội thấp nhất 15fg/µl cho hiệu quả khuếch đại chứng nội kém nhất so với các nồng độ khác. nồng độ chứng nội từ 1,5pg/µl đến 150pg/µl cho kết quả
khuếch đại chứng nội tốt nhưng lại ức chế hiệu quả khuếch đại các gen mục tiêu. Nồng độ chứng nội 150fg/µl cho kết quả khuếch đại chứng nội có thể phát hiện
được, đồng thời ít ảnh hưởng đến hiệu hưởng đến hiệu quả khuếch đại các gen mục tiêu (hình 3.29). Chính vì vậy nồng độ chứng nội 150fg/µl sẽ được sử dụng trong mỗi hỗn hợp phản ứng multiplex RT-PCR. Hình 3.29. Kết quả khảo sát nồng độ chứng nội trong phản ứng RT-PCR 1-2: IC 150pg/µl (nồng độ RNA ở 1 > nồng độ RNA ở 2) 3-4: IC 15pg/µl (nồng độ RNA ở 3 > nồng độ RNA ở 4) 5-6: IC 1,5pg/µl (nồng độ RNA ở 5 > nồng độ RNA ở 6) 7-8: IC 150fg/µl ((nồng độ RNA ở 7 > nồng độ RNA ở 8) 9-10: IC 15fg/µl ((nồng độ RNA ở 9 > nồng độ RNA ở 10) M. Thang 100bp. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M
~ 77 ~
3.1.5.3. Khảo sát nồng độ mồi cho phản ứng multiplex RT-PCR có chứng nội
Trong mục 3.3.1.2 (b), chúng tôi đã xác định được không có sự cạnh tranh giữa các mồi trong phản ứng multiplex RT-PCR (không có chứng nội), nồng độ
các độ mồi có thể sử dụng là 0,8µM. Trong phản ứng multiplex RT-PCR có chứng nội, nồng độ các mồi có thể ảnh hưởng lên việc khuếch đại các gen mục tiêu cũng như chứng nội do mồi sử dụng để khuếch đại chứng nội đồng thời cũng khuếch đại cả gen mục tiêu M. Do đó chúng tôi tiến hành khảo sát lại nồng
độ các mồi trong phản ứng multiplex RT-PCR có chứng nội.
Nồng độ chứng nội được sử dụng trong khảo sát là 150fg/µl. Các nồng độ
mồi được khảo sát theo bảng 3.1.
Bảng 3.1. Nồng độ mồi được khảo sát trong phản ứng multiplex RT-PCR có chứng nội Mồi Nghiệm thức (NT) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 MA-12F (µM) 0,4 0,4 0,4 0,6 0,8 0,6 0,6 0,8 0,8 1,0 MA-225R (µM) 0,4 0,4 0,4 0,6 0,8 0,6 0,6 0,8 0,8 1,0 H1-224F (µM) 0,4 0,6 0,8 0,4 0,4 0,6 0,8 0,6 0,8 1,0 H1-525R (µM) 0,4 0,6 0,8 0,4 0,4 0,6 0,8 0,6 0,8 1,0 Hình 3.30. Kết quả nồng độ mồi trong phản ứng multiplex RT-PCR có chứng nội NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 NT6 NT7 NT8 NT9 NT10 M
~ 78 ~
Kết quả hình 3.30 cho thấy ở các nồng độ mồi thấp ≤ 0,6µM, hiệu quả
khuếch đại gen mục tiêu cũng như chứng nội không cao (NT1 NT6) so với các nồng độ mồi > 0,6µM (NT7 NT10). Trong số các nghiệm thức (NT) cho hiệu quả khuếch đại cao, NT7 có nồng độ mồi tương đối thấp, nhưng hiệu quả
khuếch đại tương đương với các nồng độ mồi cao hơn (NT8 – NT10). Do đó nồng độ mồi trong NT7 sẽđược sử dụng.
3.1.6. Khảo sát độ nhạy và độđặc hiệu
3.1.6.1. Khảo sát giới hạn phát hiện của phương pháp
Số lượng bản sao bộ gen virút cúm A/H1N1-2009 được xác định bằng phương pháp real-time RT-PCR sử dụng RNA gen H1 và gen MA chuẩn (Roche) (hình 3.31). Sau khi được xác định, số lượng bản sao virút được pha loãng bậc 10 và có nồng độ lần lượt 2,5x106; 2,5x105; 2,5x104; 2,5x103; 2,5x102; 12,5x101 và 25x100. Tất cả các nồng độ bản sao này được kiểm tra bằng phương pháp multiplex RT-PCR nhằm xác định ngưỡng giới hạn phát hiện của phương pháp. Hình 3.31. Xác định số bản sao gen H1 bằng phương pháp rRT-PCR
~ 79 ~
Kết quả cho thấy khả năng phát hiện của phương pháp multiplex RT-PCR là 125 bản sao gen H1 và MA trong 25µl phản ứng (hình 3.32). Như vậy khả
năng phát hiện của phương pháp là khoảng 9000 bản sao RNA virút cúm A/H1N1-2009 trong 1ml môi trường vận chuyển (~ 3,9log bản sao RNA/ml). Trong nghiên cứu của Panning (2009) xác định nồng độ virút cúm trong môi trường vận chuyển bệnh phẩm dươngcúm A/H1N1-2009 tính trung bình vào khoảng 40000 bản sao RNA virút cúm trong 1ml (~4,6log bản sao RNA/ml) [38], gấp 4 lần khả năng phát hiện của phương pháp multiplex RT-PCR. Do đó kết quả đạt được chứng minh tính khả thi của phương pháp trong xét nghiệm virút cúm A/H1N1-2009 từ bệnh phẩm.
3.1.6.2. Khảo sát độ nhạy của phương pháp
Để đánh giá độ nhạy của phương pháp, 241 mẫu bệnh phẩm đã được kiểm tra đồng thời bằng phương pháp multiplex RT-PCR và rRT-PCR (theo protocol của CDC) và sau đó được xác định lại bằng phương pháp nuôi cấy. Kết quả cho
Hình 3.32. Giới hạn phát hiện của phương pháp multiplex RT-PCR 1. 2,5x106 bản sao; 2. 2,5x105 bản sao; 3. 2,5x104 bản sao; 4. 2,5x103 bản sao; 5. 2,5x102 bản sao; 6. 12,5x101 bản sao; 7. 25x100 bản sao; 8. Thang 100bp 1 2 3 4 5 6 7 M
~ 80 ~
thấy 63 mẫu dương tính đồng thời cả 2 phương pháp multiplex RT-PCR và rRT- PCR, 175 mẫu âm tính với cả 2 phương pháp (bảng 3.2). Ngoài ra có 3 mẫu chỉ được phát hiện dương tính bằng phương pháp rRT-PCR và được xác định dương tính bằng phương pháp nuôi cấy (hình 3.34). Cả 3 mẫu này có lượng bản sao RNA virút cúm A/H1N1-2009 >2,9log/ml môi trường vận chuyển.
Bảng 3.2. So sánh kết quả 2 phương pháp multiplex RT-PCR và rRT-PCR rRT-PCR (Invitrogen – CDC Hoa kỳ) Dương tính Âm tính Multiplex RT-PCR Dương tính 63 0 Âm tính 3* 175
* kết quả được xác định bằng phương pháp nuôi cấy
Hình 3.33. Kết quả 28 trong số 63 mẫu dương tính cúm A/H1N1-2009 xét nghiệm bằng multiplex RT-PCR. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 M
~ 81 ~
Kết quả trên cho thấy độ nhạy của phương pháp multiplex RT-PCR so với phương pháp chuẩn của CDC trong phát hiện virút cúm A/H1N1-2009 là 95%.
Đồng thời ta cũng xác định được độ đặc hiệu của phương pháp multiplex RT- PCR trong thí nghiệm này 1à 100%.
Ngoài ra các giá trị tiên đoán dương (PPV) và giá trị tiên đoán âm (NPV) của phương pháp multiuplex RT-PCR cũng được xác định.
Giá trị tiên đoán dương (PPV) được định nghĩa là giá trị đánh giá khả
năng nhiễm bệnh của một kết quả dương tính. Giá trị này càng cao thì khả năng
đánh giá đúng dựa vào kết quả xét nghiệm càng chính xác. Từ kết quả trong bảng 3.2, giá trị tiên đoán dương của phương pháp multiplex được tính như sau:
PPV = [63/(63+0)]x100% = 100%. Như vậy phương pháp có giá trị tiên đoán
dương là 100%.
Giá trị tiên đoán âm (NPV) được định nghĩa tương tự giá trị tiên đoán dương nhưng về khía cạnh đánh giá khả năng không nhiễm bệnh của một kết quả
âm tính và giá trị này càng cao thì khả năng đánh giá càng chính xác. Với cách tính tương tự giá trị tiên đoán dương, giá trị tiên đoán âm của phương pháp
Hình 3.34. Kết quả nuôi cấy mẫu bệnh phẩm virút cúm A/H1N1-2009 a. chứng âm; b. chứng dương với chủng NIBRG-121; c. mẫu nuôi cấy lúc 0 giờ; d. mẫu nuôi cấy sau 72 giờ.
~ 82 ~
multiplex là: NPV = [175/(175+3)]x100% = 98,3%. Như vậy phương pháp có giá trị tiên đoán âm là 98,3%.
3.1.6.3. Khảo sát độ lặp lại
Độ lặp lại được kiểm tra với 2 nhân viên xét nghiệm khác nhau cùng thực hiện phản ứng cho 5 mẫu bệnh phẩm nhưng sử dụng cùng lô hỗn hợp RT-PCR. Kết quả xét nghiệm của 2 nhân viên cho thấy 5 mẫu bệnh phẩm có kết quả tương
đồng hoặc dương hoặc âm (hình 3.35). Như vậy chứng tỏ độ lặp lại của hỗn hợp phản ứng RT-PCR trong thí nghiệm đạt 100%.
3.1.7. Tạo chứng dương
Virút cúm A/H1N1 đại dịch 2009 có thể được phân lập và nuôi cấy trên trứng gà có phôi hay tế bào động vật (MDCK). Bộ gen RNA virút có thể được
1a 2a 3a 4a 5a M 1b 2b 3b 4b 5b
Hình 3.35. Kết quảđộ lặp lại của phản ứng mRT-PCR
1a – 5a: phản ứng được thực hiện bởi nhân viên 1 1b – 5b: phản ứng được thực hiện bởi nhân viên 2 M: thang 100bp
~ 83 ~
tách chiết dễ dàng thông qua các kit thương mại được bán trên thị trường. Do đó chúng tôi sử dụng chính RNA của virút cúm A/H1N1 đại dịch được tách chiết từ
mẫu nuôi cấy làm chứng dương cho các phản ứng RT-PCR đơn cũng như
multiplex RT-PCR trong phát hiện virút cúm A/H1N1 đại dịch nói riêng và virút cúm A nói chung.
Lưu ý quan trọng khi sử dụng RNA làm chứng dương là chúng phải được bảo quản trong điều kiện thích hợp nhằm đảo bảo chất lượng. Tùy theo mục đích nghiên cứu RNA virút có thể được bảo quản trong các dung dịch như muối citrat 1mM (pH 6,4), EDTA 0,1mM (trong nước được sử lý DEPC), đệm TE (pH 7,0), nước được sử lý DEPC… sau đó được giữở -20oC hoặc -70oC.
Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng bộ kit thương mại QIAamp viral RNA mini kit (Qiagen) để tách chiết RNA bộ gen virút cúm A/H1N1 đại dịch. Do đó dung dịch bảo quản RNA sau cùng là TE (pH 7,0). Các điều kiện nhiệt độ
và thời gian bảo quản RNA bộ gen virút được khảo sát. Kết quả cho thấy RNA bộ gen virút trong môi trường TE (pH 7,0) được bảo quản ở nhiệt độ -20oC và - 70oC không có sự thay đổi đáng kể sau 5 tháng. Ngược lại RNA bộ gen virút
được trữ ở 4oC và nhiệt độ phòng không thể được phát hiện bằng PCR (hình 3.36). Hình 3.36. Kết quả bảo quản RNA virút 1: chứng dương; 2: 4oC; 3: nhiệt độ phòng; 4: -70oC; 5: -20oC; M: thang 100bp 1 M 2 3 4 5
~ 84 ~
Từ kết quả đạt được có thể kết luận RNA bộ gen virút (được sử dụng làm chứng dương) trong dung dịch TE (pH 7,0) có thể được bảo quản ở nhiệt độ - 20oC hoặc -70oC ít nhất 5 tháng và không nên giữ ở 4oC hay nhiệt độ phòng. Trong các khuyến cáo của các nhà khoa học, mẫu RNA tách chiết cũng chỉ nên
được giữa ở 4oC trong vòng nhiều nhất một tuần, nếu muốn giữ lâu hơn cần trữ
mẫu ở điều kiện âm sâu (tài liệu tham khảo). Ngoài ra một số hãng thương mại cũng đã tạo ra chất bảo quản RNA ở nhiệt độ phòng nhằm giúp thuận tiện cho quá trình bảo quản và vận chuyển như kít RNAstable của hãng Biomtrica.