L ời mở đầu
3.1.3. Khảo sát hỗn hợp enzyme phản ứng RT-PCR
Phản ứng khuếch đại chuỗi kết hợp phiên mã ngược (RT-PCR) là phản
ứng sử dụng bản mẫu ban đầu (mạch khuôn) là các phân tử RNA (thay vì phân tử DNA như phản ứng khuếch đại chuỗi PCR thông thường). Như vậy để thực hiện được bước khuếch đại chuỗi, các RNA phải được chuyển thành các cDNA (complementary DNA) bằng enzyme phiên mã ngược reverse transcriptase. Từ
các cDNA mới tạo thành, enzyme DNA polymerase sẽ thực hiện chức năng khuếch đại chuỗi, khuếch đại đoạn DNA mong muốn .
Hai giai đoạn phiên mã ngược và khuếch đại chuỗi có thể được thực hiện trong hai phản ứng đơn khác nhau (sử dụng hai tube phản ứng). Quá trình thực hiện RT-PCR theo hai bước tốn nhiều thời gian và công sức thực hiện. Ngày nay các nhà khoa học đã thực hiện việc kết hợp 2 enzyme reverse transcriptase và DNA polymerase để tạo nên hỗn hợp enzyme nhằm thực hiện phản ứng RT-PCR
~ 56 ~
chỉ trong một tube phản ứng. Các hỗn hợp enzyme này đã được thương mại hóa. Ngoài ra có một số enzyme có thể thực hiện cả 2 chức năng reverse transcriptase và polymerase như enzyme Tth DNA polymerase.
Trong nghiên cứu này chúng tôi thực hiện việc thử nghiệm tạo một số hỗn hợp enzyme revserse transcriptase và DNA polymerase nhằm tìm ra hỗn hợp cho kết quả khuyếch đại tối ưu, đồng thời so sánh với các hỗn hợp enzyme được thương mại trên thị trường hiện nay. Qua quá trình khảo sát chúng tôi đã tìm
được hỗn hợp hai enzyme có thể trộn chung với nhau (hỗn hợp 5) và cho kết quả
khuếch đại tốt hơn các hỗn hợp enzyme khác cùng thí nghiệm (hình 3.8). Hỗn hợp 5 bao gồm enzyme reverse transcriptase của hãng Sigma (eAMV-RT) và enzyme Taq polymerase được tạo ra ở trên.
Từ kết quả ban đầu đạt được của hỗn hợp enzyme trên, chúng tôi tiến hành khảo sát thành phần tỷ lệ các enzyme trong hỗn hợp để tìm ra tỷ lệ thích hợp nhất. Tỷ lệ DNA polymerase/reverse transcriptase (U/U) được khảo sát là 0,5; 1; 1,5; 2 và 4. Kết quả cho thấy với tỷ lệ 2,0 (đơn vị DNA polymeasre/đơn vị
reverse transcriptase), hỗn hợp enzyme cho kết quả phiên mã ngược và khuếch
đại chuỗi hiệu quả hơn các tỷ lệ khác (hình 3.9).
Hình 3.8. So sánh hỗn hợp enzyme RT-PCR
1. Hỗn hợp 1; hỗn hợp 2; hỗn hợp 3 4. hỗn hợp 4; 5. hỗn hợp 5.
~ 57 ~
Ngoài hỗn hợp enzyme, các thành phần khác của phản ứng cũng ảnh hưởng đến kết quả của phản ứng RT-PCR, đặc biệt là thành phần đệm (buffer). Qua quá trình khảo sát chúng tôi ghi nhận với thành phần đệm bao gồm Tris-HCl 10mM (pH 8,3); KCl 100mM, (NH4)2SO4 15mM và MgCl2 3mM cho kết quả
phản ứng RT-PCR ổn định. Ngoài ra trong phản ứng sử dụng RNA làm khuôn mẫu cần phải bổ sung chất ức chế enzyme Rnase để đảm bảo mạch khuôn RNA không bị phân hủy.
Như vậy chúng tôi đã xác định các thành phần cần thiết để thực hiện phản
ứng RT-PCR bằng hỗn hợp nghiên cứu (được đặt tên là pMIX RT-PCR). Tiếp theo hỗn hợp này được thực hiện so sánh với các hỗn hợp (kit) thương mại được bán trên thị trường.
1 2 3 4 5 Hình 3.9. Khảo sát tỷ lệ thành phần hỗn hợp enzyme
1. tỷ lệ 0,5; 2. tỷ lệ 1,0; 3. tỷ lệ
~ 58 ~
Kết quả so sánh các hỗn hợp enzyme cho thấy hỗn hợp pMIX RT-PCR cho hiệu quả khuếch đại tương hỗn hợp enzyme thương mại Transcriptor RT-PCR (Roche) và hơn hẳn hỗn hợp iScript One-Step RT-PCR (Biorad) hay enzyme Tth DNA polymerase (Roche). Tuy nhiên, hiệu quả khuếch đại cao nhất thuộc về hỗn hợp OneStep RT-PCR của Qiagen (hình 3.10). Mặc dù giá thành của hỗn hợp OneStep RT-PCT (Qiagen) khá cao hơn so với hỗn hợp pMIX RT-PCR (PI
HCMC) nhưng do hiệu quả chất lượng phản ứng chúng tôi quyết định sử dụng hỗn hợp OneStep RT-PCR cho các khảo sát sau.
Hình 3.10. So sánh hỗn hợp các enzyme chạy RT-PCR 1 tube
Kít OneStep RT-PCR (Qiagen): nồng độ RNA ở (1) > nồng độ
RNA ở (2); hỗn hợp pMIX RT-PCR (PI HCMC): nồng độ RNA ở
(3) > nồng độ RNA ở (4); kít Transcriptor One-Step RT-PCR (Roche): nồng độ RNA ở (5) > nồng độ RNA ở (6); kít iScript One-Step RT-PCR (Biorad): nồng độ RNA ở (7) > nồng độ RNA
ở (8); kít Tth DNA polymerase (Roche): nồng độ RNA ở (9) > nồng độ RNA ở (10); M: thang 100bp
~ 59 ~