1. 1T NG QUA NV AFLATOXIN
3.3 NGHIÊN CUNG D NG CH P HM AF
3.3.1.1 Nghiên c u t l gi a ch ng sinh aflatoxin và ch ng không sinh aflatoxin A. flavus DA2
+ Kh n ng c nh tranh c a ch ph mA.flavus DA2 các t l khác nhau
Ti n hành nuôi c y ng th i ch ng sinh c t A.flavus AF14 và ch ph m ch a ch ng không sinh c t A. flavus DA2 trên môi tr ng ngô ã thanh trùng v i t l (ch ng AF14/DA2): 3/1, 2/1, 1/1 và 1/2 sao cho m t bào t t ng s t 1,5x105CFU/g ngô. Sau 9 ngày nuôi c y nhi t 30oC, s y 450C trong m t ngày ( d ng ho t ng ng c a h s iA.flavus) ti n hành tách chi t c t và xác nh hàm l ng aflatoxin b ng c ký TLC.
Hình 3.10Kh n ng c nh tranh c a A. flavus DA2 t l khác nhau
Chú thích:
Chu n: Chu n aflatoxin;
u M1: T l AF14/DA2 = 3/1;
u M2: T l AF14/DA2 = 2/1;
u M3: T l AF14/DA2 = 1/1;
ng 3.18 Kh n ng c nh tranh c a ch ph m A. flavus DA2 t l khác nhau b ng s c ký TLC
STT T l ch ng sinh c t AF14/ch ng không sinh c DA2
Aflatoxin 1 3/1 + 2 2/1 + 3 1/1 + 4 1/2 - Chú thích:+: Phát hi n có aflatoxin -: Không phát hi n aflatoxin
t qu phân tích cho th y kh n ng c ch s t o aflatoxin là không cao n u nh t ch ng A. flavus DA2 không sinh aflatoxin c s d ng th p h n ch ng AF14 sinh aflatoxin. V t aflatoxin ch hoàn toàn m t i các m u ngô khi t l A. flavus DA2 cao h n
A.flavus AF14 sinh aflatoxin.
+ Kh n ng c nh tranh c a ch ph mA. flavus DA2 trên t tr ng ngô, l c quy mô phòng thí nghi m
Ti n hành nhi m ng th i ch ngA.flavus AF14 sinh c t và A. flavus DA2 trên t tr ng ngô, l c ã ti t trùng v i m t t ng s 2x105CFU/g, t l % ch ng AF14: DA2 khác nhau: 100:0; 60:40; 50:50; 40:60 và 20:80. Sau 1 tháng, ti n hành phân l p khu n l c có c tính n hình c a A. flavus các m u t tr ng ngô, l c ã c nhi m ch ng
A.flavus AF14 sinh c t vàA.flavus DA2, c y chuy n các khu n l c này sang môi tr ng Czapek phát hi n s phát quang c a ch ngA. flavus sinh aflatoxin d i ánh sáng c c tím b c sóng 360nm. Tính t l các ch ngA. flavus phát quang màu xanh lá cây- vàng sáng trên t ng s ch ngA. flavus phân l p xác nh m c c nh tranh c a ch ng A. flavus DA2 v i A. flavus AF14 t n t i trong t tr ng ngô, l c. K t qu nghiên c u kh
ng c nh tranh c a ch ng A. flavus DA2 không sinh aflatoxin trong t tr ng ngô, l c các t l khác nhau c trình bày b ng 3.19.
ng 3.19Kh n ng c nh tranh c a ch ng A. flavus DA2 khi bón vào t các t l khác nhau
l ch ng AF14/DA2 khi nhi m vào t (%)
l ch ng AF14/DA2 sau khi nhi m vào t 01 tháng (%)
AF14 DA2 AF14 DA2
100 0 100 0
60 40 25,13 74,87
50 50 0 100
40 60 0 100
20 80 0 100
t qu b ng 3.19 cho th y, ch ngA.flavus DA2 ã th hi n tính c nh tranh cao i v i ch ngA. flavus AF14 sinh aflatoxin. Sau khi nhi m vào t tr ng ngô, l c 1 tháng, l ch ngA. flavus AF14:DA2 t 60:40; 50:50; 40:60 và 20:80 ã chuy n thành 25,13: 74,87; 0:100; 0:100; 0:100 theo th t . S li u phân tích cho th y ch ngA. flavus DA2 có kh n ng c nh tranh i v i ch ngA. flavus AF14 theo c ch lo i tr c nh tranh v i m c khác nhau tùy thu c vào t l ch ng DA2/AF14. K t qu c ng cho th y r ng v i t l 40:60 ch ngA. flavus DA2 ã có th làm gi m t l ch ngA. flavus AF14 t 60% xu ng còn 25,13%. V i t l 1/1 ch ngA. flavus DA2 ã có th c ch hoàn toàn ch ngA.flavus
AF14 sinh aflatoxin, cao h n so v i k t qu nghiên c u c a Brown và c ng s khi nuôi c y n h p hai ch ng sinh và không sinh c t v i cùng t l 1/1 (gi m aflatoxin trên ngô là 78%) [27].
t qu b ng 3.18 và 3.19 cho th y s d ng ch ph m DA2 t c hi u qu nh tranh cao c n b sung ch ph m vào môi tr ng v i m t b ng ho c l n h n ch ng
A. flavussinh c trong t nhiên.
3.3.1.2 Nghiên c u nh h ng c a th i m s d ng n kh n ng c nh tranh a ch ph m A. flavus DA2
Nhi u công trình nghiên c u c a các tác gi nh Cotty, Brown và Atenhkeng ã cho th y kh n ng c nh tranh c a các ch ngA.flavus không sinh aflatoxin ph thu c khá nhi u vào th i m s d ng ch ph m [23, 27, 42, 44, 45]. Ch ng A.flavus DA2 không sinh aflatoxin và ch ngA.flavus AF14 sinh aflatoxin c c y ng th i ho c c y cách nhau 24
gi lên môi tr ng ngô h t ã c thanh trùng (t l 1/1 m t t ng 1,5.105 CFU/g ngô). Sau 7 ngày nuôi 28oC, ti n hành tách chi t c t và ki m tra hàm l ng aflatoxin trong môi tr ng nuôi c y b ng s c kí b n m ng xác nh c th i m s d ng ch ph m h p lí cho hi u qu c nh tranh cao. K t qu ki m tra hàm l ng aflatoxin c trình bày hình 3.11.
Hình 3.11Kh n ng i kháng c a ch ph m A. flavus DA2 các th i m c y khác nhau
Chú thích: Chu n: Chu n aflatoxin B1; M u 4: Ch ng A. flavus DA2 c y tr c ch ng A. flavus AF14 24h; M u 5: C y ng th i 2 ch ng A. flavus DA2 và A. flavus
AF14; M u 6: Ch ngA. flavus AF14 c y tr c ch ngA.flavus DA2 24h.
K t qu phân tích aflatoxin hình 3.11 cho th y m u ngô c y ch ph m A.flavus
DA2 tr c AF14 24h, v t aflatoxin ã hoàn toàn không xu t hi n. m u ngô c y ng th iA.flavus DA2 và AF14 cho hi u qu gi m nhi m aflatoxin cao, v t aflatoxin m i so i m u c y ch ngA.flavus AF14 sinh aflatoxin tr c ch ph mA.flavus DA2. Hi u qu gi m nhi m aflatoxin t c trong 2 tr ng h p ch ng A.flavus DA2 c y tr c và c y
ng th i v i ch ng AF14 là khá cao. K t qu này hoàn toàn phù h p v i nh ng k t qu mà Cotty và c ng s thu c khi ti n hành các th nghi m v i ch ng A. flavus sinh c AF13 và ch ngA. flavus không sinh c AF36 c c y trên qu bông. Ch ng c AF13 sinh aflatoxin B1 v i l ng 72 ppm, khi c nuôi ng th i v i ch ng AF36, l ng aflatoxin B1 ch còn 6ppm, hi u qu gi m aflatoxin t 91,7%. Khi c y ch ng AF36 tr c ch ng AF13 24 gi thì aflatoxin B1 ch còn 0,4ppm, gi m trên 99%. Ng c l i, n u c y ch ng AF13 tr c ch ng AF36 24 gi thì hàm l ng aflatoxin không gi m [44]. Ch ng t
ng, khi c c y tr c, các ch ng sinh aflatoxin s phát tri n chi m u th v s l ng, làm gi m tác d ng i kháng c a ch ng không sinh aflatoxin. T k t qu này cho th y khi ch ph m A.flavus DA2 không sinh aflatoxin c s d ng s m và liên c trên các mùa
liên ti p s mang l i hi u qu c nh tranh t t nh t.
Trên c s k t qu các b ng 3.18 và 3.19, hình 3.10 và 3.11 có th kh ng nh, khi tri n khai trên ng ru ng nên s d ng ch ph mA.flavus DA2 tr c th i m mà nh ng ch ng n m m c sinh c t nhiên có nguy c nhi m hay khi có d u hi u nhi m trên cây tr ng, t t nh t là dùng ngay t u v tr c khi gieo tr ng t o u th c nh tranh. S
ng m t l ng l n ch ph mA.flavus DA2 thì hi u qu c nh tranh v n khá cao cho dù trong t ã b nhi mA.flavus sinh c t t tr c ó.
3.3.1.3 Nghiên c u nh h ng c a thu c b o v th c v t hóa h c n sinh tr ng, phát tri n và kh n ng c nh tranh c a ch ng A. flavus DA2
+ nh h ng c a thu c b o v th c v t hóa h c n kh n ng phát tri n c a ch ng
A.flavus DA2
t ch ph m n m i kháng khi c a ra ng d ng trên quy mô ng ru ng c n ph i quan tâm n kh n ng t ng tác v i các lo i thu c hóa h c th ng c s d ng
o v cây tr ng nh các lo i thu c tr sâu, thu c di t c … Các lo i thu c này có th gây c ch s phát tri n sinh kh i và làm gi m hi u qu c nh tranh c a ch ph m n m i kháng.
Ch ngA. flavus DA2 c nuôi trên môi tr ng PDA l ng, l c 200v/phút 30oC. Thu c tr sâu và thu c di t c c b sung v i nh ng n ng khác nhau vào m u thí nghi m. Sau 7 ngày nuôi ti n hành thu sinh kh i, r a s ch, s y khô n kh i l ng không i và cân ki m tra s nh h ng c a các lo i thu c n s phát tri n sinh kh i c a
A.flavus DA2.
Thu c b o v th c v t c ng i dân s d ng ph bi n di t sâu và tr c trên ngô, l c là thu c tr sâu Sumithion 50EC (ch a 95% ho t ch t Fenitrothion do công ty Sumitomo Chem. Co.,Ltd Nh t B n s n xu t) và thu c di t c Saicoba 800EC (ch a 80% ho t ch t Acetochlor do công ty C ph n B o v Th c v t Sài Gòn s n xu t) ã c ch n s d ng trong thí nghi m này. nh h ng c a thu c tr sâu Sumithion 50EC và thu c tr c Saicoba 800EC nA.flavus DA2 c trình bày trong b ng 3.18
ng 3.20. nh h ng c a các thu c b o v th c v t hóa h c n s phát tri n sinh kh i c a ch ng A. flavus DA2
Thu c tr sâu Sumithion 50EC Thu c di t c Saicoba 800EC
ng (ml/l) Sinh kh i A.flavus DA2 (g/l) ng (ml/l) Sinh kh i A.flavus DA2 (g/l) 0 8,1 ± 0,22 0 8,2 ± 0,07 1 8,2 ± 0,13 1,5 8,3 ± 0,21 3 8,5 ± 0,21 3,0 7,9 ± 0,01 5 8,2 ± 0,24 4,5 8,0 ± 0,03 7 8,0 ± 0,09 6,0 8,1 ± 0,04 9 8,1 ± 0,16 7,5 8,3 ± 0,21 11 7,9 ± 0,19 9,0 8,2 ± 0,04 13 8,4 ± 0,09 10,5 8,3 ± 0,28 15 8,0 ± 0,36 12,0 8,4 ± 0,30 17 8,3 ± 0,36 13,5 8,4 ± 0,12
t qu b ng 3.20 cho th y, thu c tr sâu Sumithion 50EC và thu c tr c Saicoba 800EC u không nh h ng n s phát tri n sinh kh i c aA.flavus DA2 trong u ki n phòng thí nghi m. Khi t ng n ng thu c b o v th c v t g p 6 l n n ng s d ng ngoài th c t v n không th y có s nh h ng nào n s phát tri n sinh kh i c aA. flavus
DA2. (N ng khuy n cáo s d ng c a Sumithion 50EC là 2,5ml/l, Saicoba 800EC là 1,5ml/l).
t qu này c ng phù h p v i nghiên c u c a Pit và c ng s , khi nuôi c y ch ng
A.flavus trên môi tr ng czapek cao n m men ch a n ng thu c di t c paraquat và trifluralin g p 5-10 l n n ng yêu c u mà không cho th y s c ch rõ ràng i v i s sinh tr ng c aA.flavus [109]. M t nghiên c u khác c a Gaber và c ng s c ng cho th y, kh n ng t o bào t c a ch ng AF36 không b nh h ng khi nuôi c y v i các ch t di t c Direx 4L®, Goal® 1.6 E và Gramoxone® Extra n ng khuy n cáo s d ng [69].
+ nh h ng c a thu c b o v th c v t hóa h c n kh n ng c nh tranh c a ch ph mA.flavus DA2
ki m tra s nh h ng c a các lo i thu c tr sâu Sumithion 50EC và thu c tr c Saicoba 800EC n kh n ng c nh tranh c a ch ph m i v i A.flavus AF14. Ch ng
A.flavus DA2 c ti n hành nuôi ng th i v i ch ng sinh c t A.flavus AF14 trong môi tr ng PDA l ng (t l 1:1, v i m t t ng 1,5x105 CFU/ml), l c 200 vòng/phút 30oC. Các lo i thu c trên c b sung vào các m u thí nghi m v i n ng thông th ng
c khuy n cáo s d ng (thu c tr sâu 2,5 ml/L, thu c di t c 1,5 ml/L). Sau 9 ngày nuôi, ti n hành thu d ch nuôi, tách chi t và xác nh hàm l ng aflatoxin b ng ph ng pháp s c kí b n m ng TLC.
Hình 3.12 Kh n ng i kháng c a ch ng A. flavus DA2 khi có m t c a thu c b o v th c v t
Chú thích: TC+DA2: AflavusDA2 nuôi c y trong môi tr ng có thu c tr c ;chu n B1: Aflatoxin B1 chu n;TC+AF14: AflavusAF14 nuôi c y trong môi tr ng có thu c tr ;
TC+HH: H n h p DA2 và AF14 nuôi c y trong môi tr ng có thu c tr c ; TS+DA2:
AflavusDA2 nuôi c y trong môi tr ng có thu c tr sâu; TS+HH: H n h p DA2 và AF14 nuôi c y trong môi tr ng có thu c tr sâu; TS+AF14:AflavusAF14 nuôi c y trong môi tr ng có thu c tr sâu;
t qu hình 3.12 cho th y, thu c di t c Saicoba 800EC và thu c tr sâu Sumithion 50EC không làm gi m kh n ng c nh tranh c a ch ngA.flavus DA2. Khi nuôi c y h n h p ch ng DA2 và AF14 trên môi tr ng khoai tây l ng có b sung 2 lo i thu c hóa h c này t aflatoxin trên b n m ng m i, ch ng t hi u qu gi m nhi m aflatoxin t c v n khá cao.
Thu c tr sâu Sumithion 50EC và thu c tr c Saicoba 800EC n ng khuy n cáo d ng trên ng ru ng không làm nh h ng n kh n ng sinh tr ng, phát tri n c ng nh kh n ng c nh tranh c a ch ngA. flavusDA2.
Tuy nhiên, do t p quán canh tác ng i dân th ng s d ng r t nhi u lo i thu c b o v th c v t hóa h c, vì v y c n có thêm nghiên c u v nh h ng c a các nhóm thu c khác nhau lên kh n ng sinh tr ng, phát tri n c ng nh hi u qu c nh tranh c a ch ng DA2. Do ó, m b o hi u qu phòng ch ng n m m c và c t aflatoxin nên s d ng ch ph mA.flavus DA2 sau khi ã k t thúc quá trình s d ng thu c di t c .
3.3.2 Nghiên c u quy mô ng ru ng
3.3.2.1 ánh giá m c nhi m A. flavus trên t tr ng ngô, l c
t v n quan tr ng c nhi u nhà khoa h c quan tâm là s có m t c a loài m gây h iA. flavustrên t tr ng c a m t s t nh, m t c a nó có nh h ng l n n ch t l ng nông s n nói chung trong giai n sau thu ho ch và li u s d ng phù h p c a ch ph m AF khi ng d ng trên ng ru ng. M t n m m c A. flavus nhi m trong t tr ng ngô, l c t i các t nh V nh Phúc, Ngh An, c Nông c xác nh theo ph ng pháp a Raper và Fennel [114]. K t qu c trình bày trong b ng 3.21
ng 3.21 M c nhi m n m m c A. flavus trên t tr ng ngô, l c t i m t s t nh Vi t Nam
STT Tên m u a m y m u l ng u m u phân p cóA. flavus t A. flavus trong tx104 (CFU/g) 1 t tr ng ngô 15 8 2,0 ± 0,07 2 t tr ng l c nh Phúc 15 7 1,2 ± 0,11 3 t tr ng ngô 40 22 2,2 ± 0,19 4 t tr ng l c Ngh An 40 20 1,7 ± 0,13 5 t tr ng ngô 15 6 1,2 ± 0,17 6 t tr ng l c c Nông 15 7 1,5 ± 0,18 T ng s 140 70
t qu b ng 3.21 cho th y, s m u t có A. flavus trên t ng s m u t phân tích các t nh kh o sát có s chênh l ch nhau không áng k , dao ng t 6/15 m u n 22/40 u. Trong ó, m t nhi mA. flavustrong t tr ng ngô t i a m l y m u c a Ngh An cao h n so v i m t A. flavus trong t c a c Nông và V nh Phúc v i m t theo th t là 2,2x104CFU/g, 1,2x104CFU/g và 2,0x104CFU/g. T ng t , m t A. flavus
trong t tr ng l c t i Ngh An (1,7x104 CFU/g) c ng cao h n m t A. flavus c a các nh c Nông (1,5x104CFU/g) và V nh Phúc (1,2x104CFU/g). Theo nghiên c u c a Ablas