1. 1T NG QUA NV AFLATOXIN
2.2.3 Sàng lc sb các ch ng sinh và không sinh aflatoxi nb ng ph ng pháp
pháp phát quang
Sàng l c b ng ph ng pháp nuôi c y các ch ng A. flavus trên môi tr ng Czapek - Dox, phát hi n các ch ngA. flavus sinh và không sinh aflatoxin thông qua s phát quang a aflatoxin sinh ra trong môi tr ng d i tia UV 360nm theo ph ng pháp c a Hara và ng s [76].
2.2.4 Phân tích aflatoxin b ng s c ký b n m ng
Phân tích nh tính và nh l ng aflatoxin b ng s c ký b n m ng (TLC) c ti n hành theo ph ng pháp c a AOAC [22]
2.2.5 Phân tích aflatoxin b ng s c ký l ng cao áp
Phân tích aflatoxin b ng s c ký l ng cao áp c ti n hành theo TCVN 6953:2001[15].
2.2.6 Nuôi c y n m m c A. flavus cho vi c nghiên c u kh n ng t oaflatoxin aflatoxin
Nghiên c u kh n ng t o aflatoxin c a các ch ng A. flavus c ti n hành theo ph ng pháp c a Tanaka và c ng s [124].
Chu n b ngô làm môi tr ng nuôi c y n m m cA.flavus: u ngô s ch c xác nh không nhi m aflatoxin b ng ph ng pháp phân tích aflatoxin c a AOAC. Cho 30g ngô s ch vào bình tam giác, tr n u v i 3 ml n c c t. Kh trùng 121°C trong 30 phút. y 1ml ch ng A.flavus phân l p c v i n ng 109 CFU/ml vào môi tr ng ngô không nhi m aflatoxin ã c chu n b . NuôiA.flavus 28°C trong 7 ngày. M i ngày l y ra l c u. Sau 7 ngày nuôi c y chi t su t và xác nh hàm l ng aflatoxin có m t trong môi tr ng b ng ph ng pháp s c ký b n m ng (TLC) và s c ký l ng cao áp (HPLC).
2.2.6 Xác nh kh n ng c nh tranh c a các ch ng A. flavus không sinhaflatoxin i v i ch ngA. flavus sinh aflatoxin aflatoxin i v i ch ngA. flavus sinh aflatoxin
c ti n hành theo ph ng pháp c a Tanaka và c ng s [124].
Ch ngA. flavus sinh aflatoxin c nuôi h n h p v i t ng ch ngA. flavus không sinh aflatoxin theo t l 1:1 (m t c y 1,5x105CFU/g), nuôi c y trên c ch t ngô s ch không có aflatoxin, nuôi 7 ngày trong u ki n nhi t 28oC, m 25%, choA. flavus
sinh tr ng, phát tri n. Sau ó ti n hành chi t su t aflatoxin ánh giá kh n ng c nh tranh c a t ng ch ngA. flavuskhông sinh aflatoxin i v i ch ng sinh aflatoxin thông qua
gi m hàm l ng aflatoxin trong môi tr ng nuôi c y.
2.2.7 Nghiên c u kh n ng t o bào t c a ch ng A. flavus DA2 các u ki n nuôi c y khác nhau
+ Xác nh nh h ng c a môi tr ng nuôi c y n s t o bào t c a ch ngA. flavus
DA2:Ti n hành nuôi c y ch ng n m m cA. flavus DA2 trên 4 môi tr ng khác nhau: môi tr ng cám tr u (MT1), cám (MT2), b t ngô(MT3) và ngô h t (MT4). Sau 7 ngày xác nh kh n ng t o bào t c a ch ngA. flavus DA2.
+ Xác nh nh h ng c a nhi t nuôi c y n s t o bào t c a ch ng A. flavus
DA2:Cân 100 g môi tr ng cám tr u (môi tr ng MT1) vào bình tam giác 500ml, thanh trùng 121oC trong 30 phút. C y ch ngA. flavusDA2 i t l 10%, tr n u và nuôi c y các nhi t 24, 26, 28, 30, 32 và 340C. Sau 7 ngày xác nh kh n ng t o bào t c a ch ng
A. flavus DA2.
+ Xác nh nh h ng c a m môi tr ng ban u n s t o bào t c a ch ng A. flavus DA2:Cân 100g môi tr ng cám tr u vào bình tam giác 500ml, u ch nh các
m khác nhau: 55, 60, 65, 70 và 75%, thanh trùng 121oC trong 30 phút. C y ch ng A. flavusDA2, l c u. Nuôi c y 30oC. Sau 7 ngày xác nh kh n ng t o bào t c a ch ng
A. flavus DA2.
+ Xác nh nh h ng c a th i gian nuôi c y n s t o bào t c a ch ng A. flavus
DA2:Cân 100g môi tr ng cám tr u vào bình tam giác 500ml, thanh trùng 1210C trong 30 phút. C y ch ngA. flavusDA2 i t l 10%, tr n u, nuôi c y t i 300C. ánh giá kh
2.2.8 Quy trình nuôi c y n m m cA. flavus DA2 qui mô phòng thí nghi m
Nuôi n m m cA. flavusDA2 trên môi tr ng PDA ng th ch nghiêng 4-5 ngày trong t m 300C, sau ó dùng 10ml n c c t vô trùng thu d ch ch a bào t . Chuy n n d ch gi ngA. flavus DA2 sang bình tam giác 500ml có ch a 150ml môi tr ng PDA. Gi ng bình tam giác này c nuôi l c 200 vòng/phút 30oC trong 48 gi . Sau ó c y 10% h n d ch n m trên cho vào bình tam giác 500ml có ch a 100g môi tr ng cám tr u. Nuôi 30oC trong th i gian 9 ngày.
2.2.9 T o ch ph m ch a bào t ch ngA. flavus DA2 (ch ph m AF)
Sinh kh i và b o t A. flavusDA2 c nuôi c y theo ph ng pháp 2.2.8. em ph i tr n sinh kh i và bào t thu c v i các ch t mang khác nhau theo công th c: (1) Công th c 1: t l 1 ph n sinh kh i ch ngA.flavus DA2: 1 than bùn, tr n u óng gói b ng túi nilon; (2)Công th c 2: t l 1 ph n sinh kh i ch ngA.flavus DA2: 1 Canxi alginat, tr n u óng gói b ng túi nilon; (3)Công th c 3: t l 1 ph n sinh kh i ch ngA.flavus DA2: 1 cám g o, tr n u óng gói b ng túi nilon. Sau ó nh l ng m t bào t A.flavus
DA2 trong các công th c t o ch ph m khác nhau theo ph ng pháp c nêu m c 2.2.10.
2.2.10 nh l ng m t bào t A. flavus trong ch ph m
t bào t ch ngA.flavus DA2 trong ch ph m c xác nh theo ph ng pháp a Nguy n Lân D ng và c ng s [8].
Cân 20g ch ph m ã c s y khô 45oC trong 48h, hòa vào bình tam giác ch a 180ml n c c t vô trùng, sau ó pha loãng h n d ch trên t i 10-7, môi tr ng PDA c chu n b s n trên a Petri. Hút 100 l d ch các pha loãng 10-5, 10-6, 10-7 trang u ch n m trên a th ch, khô m t th ch sau ó nuôi trong t m 30oC, sau 3- 5 ngày m
khu n l c. S l ng bào t n m m c N/g m u c tính b ng công th c: N= ( khu n l c m c n ng xác nh)x (h s pha loãng)
2.2.11 Xác nh s có m t c a m t s gen trong c m gen mã hóa cho cácenzym tham gia vào quá trình sinh t ng h p aflatoxin c a các ch ng A. enzym tham gia vào quá trình sinh t ng h p aflatoxin c a các ch ng A.
flavus b ng k thu t multiplex PCR
2.2.11.1 Tách chi t ADN t ng s
Ti n hành tách chi t ADN t ng s c a các ch ng A. flavus theo ph ng pháp c a Sambrook và ng s [117].
m m c nuôi l c trong môi tr ng PDA l ng (5 ngày); L c thu sinh kh i, r a sinh kh i b ng EDTA; L y kho ng 0,5 ml sinh kh i, b sung 1ml m (Tris, EDTA, CTAB, NaCl, - mercaptoetanol 1%); Siêu âm 5 phút (5 giây ngh 5 giây); 70oC trong 45 phút (c 5 phút vortex m t l n); Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút, nhi t th ng; Thu 700 µl d ch n i, 700 µl CIAA, o tr n m nh; Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút, nhi t th ng; Thu 400 µl d ch n i, b sung 400 µl isopropanol, o tr n m nh; Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 15 phút, nhi t th ng; Thu k t t a (ADN), r a k t t a b ng 1.000 µl c n 70%, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 5 phút, c n, làm khô c n ADN trong máy SpeedVac; Hòa tan c n ADN trong 50 µl dung d ch TE; Ki m tra ch t l ng ADN trên gel agarose 1% và nh l ng b ng máy quang ph (NanoDrop, Techmo Scientific).
2.2.11.2 Thi t k m i s d ng cho ph n ng multiplex PCR
Các m i s d ng cho ph n ng multiplex PCR c thi t k nh ch ng trình PC/GENE ki m tra s có m t c a các gen quan tr ng trong con ng sinh t ng h p aflatoxin, ó là các genaflr, omt, ver vànor v i m t s c m chú ý: 1) Chi u dài c a i t 20 n 30 nucleotit; 2) B t c p vào vùng gen có tính b o th cao; 3) Tm gi a các i không c chênh l ch quá 5oC; 4) S n ph m PCR t o ra ph i có s khác bi t v dài d dàng nh n bi t khi n di trên gel [117].
2.2.11.3. Các b c c a k thu tmultiplex PCR
Ti n hành theo ph ng pháp c a Criseo và c ng s [48].
Các thành ph n tham gia PCR: n ADN khuôn, m i c hi u có chi u dài 15 - 30 nucleotit, b n lo i dNTP (dATP, dTTP, dGTP, dCTP), ADN polymeraza. PCR bao g m các giai n: 1) Giai n bi n tính ADN t d ng s i kép sang s i n nh nâng nhi t lên 94oC - 95oC trong vòng 30 giây n vài phút; 2) Giai n b t c p c a m i: Hai n
i chuyên bi t s g n v i n ADN t ng ng hai u n ADN c n nhân theo nguyên t c b sung khi h nhi t xu ng d i nhi t Tm t ng ng c a các n m i (37 - 65oC); 3) Giai n kéo dài chu i: ph n ng t ng h p phân t ADN kéo dài t n
i, th c hi n 72oC nh m tránh hi n t ng g n không c hi u.
Chu trình nhi t ti n hành PCR nhân gen: Kh i ng 94oC - 5 phút; Bi n tính 94oC - 1 phút; B t c p 65oC - 55 giây; T ng h p 72oC - 1 phút 20 giây; 35 chu k (t b c 2 n b c 4); T ng h p cu i 72oC - 8 phút, k t thúc 4oC. S n ph m PCR c ki m tra ng di n di trên gen agaroza.
2.2.11.4 n di ki m tra s n ph m PCR
Chu n b gen agarose 1,5%, vào b ng n di có l c cài s n t o các gi ng tra u; M u (s n ph m c a ph n ng PCR) c nhu m v i thu c nhu m bromophenol blue 1%; Tra m u ã nhu m vào các gi ng trên b n ch y n di. Ch y n di v i dòng n 90-120 mA, n khi các v ch màu ch y c kho ng 3/4 chi u dài b n gel có th k t thúc n di; Nhu m ADN b ng dung d ch ethydium bromide (EtBr) 1% trong 10 phút; Ki m tra k t qu d i ánh sáng t ngo i b c sóng 260nm.
2.2.12 Th nghi m tính an toàn c a ch ngA.flavus DA2
Ch ngA.flavus DA2 c ánh giá tính an toàn b ng th nghi m trên chu t tr ng gi ng Swiss t i Vi n Ki m nghi m thu c Trung ng.
Ch ngA.flavus DA2 sau khi nuôi c y b m t c lo i b tr u b ng cách rây qua rây 1,25mm. Sau ó, cân m t l ng m u th nghi n k tr n u v i dung d ch h tinh b t 5%. Chu t gi ng Swiss 40 con, cân n ng t 18-20g/con, chia làm 4 nhóm g m 1 nhóm i ch ng dùng dung d ch h tinh b t 5% và ba nhóm th theo các m c: M c li u 1: 10,0g/kg chu t/ngày; M c li u 2: 20,0g/kg chu t/ngày; M c li u 3: 30,0g/kg chu t/ngày. Chu t c nh n n 15 gi tr c khi thí nghi m, n c u ng theo nhu c u. a m u th d i ng h n d ch b ng xylanh theo ng u ng. Chu t c nuôi trong u ki n chu ng thoáng mát, m b o v sinh và ch n u ng theo nhu c u c a chu t. Theo dõi ho t ng và cân n ng c a chu t trong th i gian 7 ngày sau khi u ng. B trí thí nghi m th c tính c p c a n m m cA. flavus DA2 c trình bày b ng 2.3.
ng 2.1 B trí thí nghi m th c tính c p m u A. flavus DA2
Nhóm chu t Li u dùng (ml h n d ch th /20g chu t) Li u dùng (g m u th /kg chu t) chu t thí nghi m Nhóm ch ng 0,4ml h tinh b t x 3 l n -- 10 c li u 1 0,4ml h n d ch A x 1l n 10,0 10 c li u 2 0,4 ml h n d ch A x 2l n 20,0 10 c li u 3 0,4ml h n d ch A x 3 l n 30,0 10
2.2.13 Xác nh t l gi a ch ng sinh aflatoxin v i ch ngA.flavus DA2 khôngsinh aflatoxin sinh aflatoxin
Ti n hành nuôi c y ng th i ch ngA.flavus AF14 sinh aflatoxin và ch ngA. flavus
DA2 trên môi tr ng ngô ã thanh trùng v i t l (ch ng AF14/DA2): 3/1, 2/1, 1/1 và 1/2, sao cho m t bào t t ng s trong môi tr ng t 1,5x105CFU/g. Sau 9 ngày nuôi c y nhi t 30oC, s y 450C trong 48 gi ( d ng ho t ng s ng c a h s iA.flavus) ti n hành tách chi t c t và xác nh hàm l ng aflatoxin b ng s c ký b n m ng xác nh
l ch ngA. flavusDA2 thích h p cho hi u qu c nh tranh cao.
2.2.14 Xác nh th i m s d ng ch ph m
Ch ng không sinh aflatoxinA.flavus DA2 và ch ng sinh c t A.flavus AF14 c y ng th i ho c c y cách nhau 24 gi lên môi tr ng ngô h t ã c thanh trùng (t l 1:1, m t bào t t ng s trong môi tr ng 1,5x105 CFU/g). Sau 9 ngày nuôi 30oC, ti n hành tách chi t c t và ki m tra l ng aflatoxin t o ra trong môi tr ng nuôi b ng s c kí n m ng xác nh c th i m s d ng ch ph m h p lí, cho hi u qu c nh tranh cao.
2.2.15 ánh giá nh h ng c a m t s lo i thu c b o v th c v t
Ch ngA.flavus DA2 c nuôi trong môi tr ng khoai tây l ng có b sung các lo i thu c b o v th c v t các n ng khác nhau. Sau 7 ngày nuôi nuôi l c 200 vòng/phút, 300C, ti n hành thu sinh kh i, r a s ch, s y khô n kh i l ng không i và cân ki m tra s nh h ng c a các lo i thu c n s phát tri n sinh kh i c a ch ph m.
ki m tra s nh h ng c a các lo i thu c này n kh n ng i kháng c a ch ph m, ti n hành nuôi ng th i ch ng n m i kháng A.flavus DA2 và ch ng sinh c t aflatoxin AF14 trong môi tr ng khoai tây l ng (t l 1:1, v i m t t ng 1,5x104CFU/ml), l c 200 vòng/phút 300C. Các lo i thu c trên c b sung vào các m u thí nghi m v i n ng thông th ng c s d ng trên ngô (thu c tr sâu 3g/L, thu c di t c 1,5 g/L). Sau 7 ngày nuôi, ti n hành thu d ch nuôi, tách chi t c t và ki m tra
ng ph ng pháp s c ký b n m ng TLC.
2.2.16 ánh giá s c nh tranh c aA.flavus DA2trong t tr ng ngô, l c
c nh tranh c a ch ngA.flavus DA2 trong t tr ng ngô, l c c ti n hành theo ph ng pháp c a Abbas và c ng s [18].
Ti n hành phân l p A.flavus t các m u t tr ng ngô, l c c s d ng ch ph m AF ch a bào t ch ngA.flavus DA2 và không s d ng ch ph m AF. Nuôi c y các ch ng
A.flavus trên môi tr ng PDA. Phân l p các khu n l c có c tính n hình c aA.flavus, y chuy n các khu n l c này sang môi tr ng Czapek-Dox phát hi n s phát quang a ch ngA flavus sinh aflatoxin d i ánh sáng c c tím b c sóng 360nm. Tính t l các ch ngA.flavus phát quang màu xanh lá cây - vàng sáng trên t ng s ch ngA.flavus phân p xác nh m c c nh tranh c a ch ngA.flavus DA2 v i các ch ngA.flavus t n t i trong t tr ng ngô, l c.
2.2.17 ánh giá hi u qu gi m m t A.flavus sinh c t và aflatoxin c ach ph m AF trên ngô giai n tr c và sau thu ho ch ch ph m AF trên ngô giai n tr c và sau thu ho ch
2.2.17.1 Th nghi m quy mô ng ru ng
Lô thí nghi m:Ch ph m AF c s d ng 3 t cho cây ngô 3 v ngô liên ti p t 8/2007- 6/2008 quy mô 01ha t i xã Tam H ng, huy n Yên L c, t nh V nh Phúc. Li u s ng là 01kg/sào, giai n ngô 5 lá. Khi dùng tr n u 01kg ch ph m AF v i t b t i r c vào g c cây ngô. M i ch ch m sóc cây ngô c ti n hành nh công th c i trà.
Lô i ch ng:Lô i ch ng không s d ng ch ph m AF quy mô 0,5ha trên cùng t chân t v i lô thí nghi m s d ng ch ph m AF. M i ch ch m sóc cây ngô c ti n hành nh công th c i trà.
2.2.17.2 Th nghi m hi u qu gi m n m m c và aflatoxin trên ngô trong quá trình o qu n
Lô thí nghi m:01t n ngô thu ho ch t m i t s d ng ch ph m AF (t t th