1. 1T NG QUA NV AFLATOXIN
1.5 NGHIÊN CUNG D NG CH P HM NM A.FLAVUS KHÔNG SINH CT
KHÔNG SINH C T TRONG PHÒNG CH NG AFLATOXIN 1.5.1 S n xu t ch ph mA. flavus không sinh aflatoxin
Tr c tiên, ph i ti n hành phân l p nh ng ch ng A. flavus t t nhiên, nuôi trên môi tr ng nhân t o r i l a ch n nh ng ch ng không sinh c t . Tuy nhiên, không ph i ch ng không c nào c ng có kh n ng c nh tranh làm gi m aflatoxin [45]. Vì v y, c n ti n hành y các thí nghi m trong phòng thí nghi m, trong nhà kính và trên th c a. M t ch ng ch c l a ch n làm ch ph m khi kh n ng i kháng cao, n nh, an toàn v i ng i và ng v t.
s n xu t bào t ,A. flavus th ng c nuôi theo ph ng pháp nuôi c y b m t, ph ng pháp nuôi c y chìm c s d ng nhân sinh kh i. Trong quá trình nuôi c y, vi sinh v t ch u s tác ng c a nhi u y u t , trong ó áng chú ý là ch dinh d ng,
m, nhi t và hàm l ng oxy có trong môi tr ng.
Vi c nuôi c yA. flavus th ng ti n hành trên nh ng khay ph ng x p ch ng lên nhau và nuôi c y trong các bu ng ch a vô trùng óng kín. M t hình th c khác là nuôi c y h s i trên các c ch t r n nh lúa m , cám....
ch t dinh d ng là cám có tr n các b t ng c c, u t ng và m t s thành ph n dinh d ng khác. Ngu n carbon cho môi tr ng dinh d ng là các lo i h t nh ngô, g o, , i m ch, u t ng.. c nghi n v thành m nh kích th c kho ng 1-3mm m môi tr ng kho ng 55-65%. Khi n m phát tri n s th i CO2gây hi n t ng t a nhi t làm nóng và khô môi tr ng, vì v y c n ph i thông gió, phun mù ho c làm m tr c ti p gi cho m t ng i c a không khí kho ng 90%
s n xu t ch ph m quy mô công nghi p, Cotty và các c ng s ã phát tri n h th ng nuôi c y t o ch ph m n m AF 36 không sinh c t quy mô pilot trong nh ng
ng nuôi kín nhi t 310C trong th i gian 7-9 ngày, s d ng nguyên li u là các lo i h t nh , lúa mì và thóc. Nh ó, ti t ki m c chi phí s n xu t mà v n gi c hi u qu c a ch ph m.
Nguyên li u c thanh trùng tiêu di t vi sinh v t nhi m t p. Ti n hành c y ch ng
A. flavus không sinh c t ã c tuy n ch n, duy trì u ki n t i u n m phát tri n nh m thu l ng sinh kh i l n nh t. K t thúc quá trình nuôi c y, s y 500C và b o qu n ch ph m 50C cho n khi s d ng [57]. Khi a ch ph m ra ng ru ng, ch ng n m c không c s ti p t c phát tri n trên ch t mang (b m t h t), sau ó phân tán vào trong t và c nh tranh v i ch ng sinh aflatoxin.
n xu t ch ph m d a trên vi c t o capsule các s i n m c a ch ngA. flavus không sinh c t trong các viên alginate. t sét th ng c dùng trong các ch ph m alginate. Theo Daigle và Cotty, ch ph m t t nh t c th bao g m 1% natri alginate, 5% lõi ngô m nh và 5% gluten b t mì. K t qu cho th y, 1g ch ph m alginate có nhi u bào t
n là các h t lúa mì nhi mA. flavus. Ch ph mA. flavus duy trì s n l ng bào t có hi u c trong th i gian b o qu n là 2 n m nhi t 8°C [50].
1.5.2 ánh giá hi u qu c a ch ph mA. flavus không sinh aflatoxin quymô phòng thí nghi m và nhà kínhmô phòng thí nghi m và nhà kính mô phòng thí nghi m và nhà kính
Brown và c ng s ã có nh ng thí nghi m trên h t ngô trong phòng thí nghi m. Các t ngô này c thanh trùng và sau ó c y ch ng c, ch ng không c ho c h n h p hai ch ng (t l 1:1). Th c hi n quá trình nuôi c y và chi t su t aflatoxin, so sánh k t qu gi a các ph ng pháp x lý. Brown nh n th y, hi u qu gi m aflatoxin trong thí nghi m này là
n 78% và t 83,2% khi ch ng không sinh c t c c y tr c ch ng sinh c [27]. t nghiên c u khác trên ngô ã c Atehnkeng và c ng s công b vào n m 2008. Trong thí nghi m c a mình, Atehnkeng ã c y ch ng sinh c t trên h t ngô tr c khi c y ch ng không sinh aflatoxin 1 gi . Thí nghi m c ti n hành v i 11 ch ng A. flavus không sinh afatoxin và ch ng sinh aflatoxin La3228. K t qu hai thí nghi m ch ra ng: hàm l ng aflatoxin B (B1 + B2) gi m th p nh t là 70,1% (ch ng Ak2757), cao nh t lên n 99,9% (ch ng La3279) [23].
Thí nghi m trên h t bông trong u ki n nhà kính c Cotty và c ng s th c hi n nhi u l n vào các n m 1990, 1993, 1994. Kh n ng i kháng gi a ch ng không c v i ch ng c ph thu c khá nhi u vào th i m s d ng ch ph m. Hi u qu gi m aflatoxin t 91,7% khi ch ng AF36 không sinh c t y ng th i v i ch ng cA. flavus AF13. Khi c y ch ng AF 36 tr c ch ng AF13 m t ngày thì hi u qu gi m aflatoxin trên 99%. Tuy nhiên, n u c y ch ng AF13 tr c ch ng AF36 m t ngày thì hàm l ng aflatoxin không h gi m [42].
ánh giá hi u qu c nh tranh trong tr ng h p ch ng t o c t c y tr c ch ng không t o afaltoxin lên qu bông ang phát tri n, Cotty ã gây nhi m v i t l ch ng không sinh c t /ch ng sinh c t là 10/1. Ch ng không c c y sau ch ng c hai gi có hi u qu gi m nhi m aflatoxin cao 95,4%, trong khi n u c y sau 16 gi hi u qu gi m nhi m ch t 77,3% [42]. Có th kh ng nh, khi s d ng m t l ng l n ch ph m thì hi u qu gi m nhi m aflatoxin v n khá cao cho dù ã b nhi mA. flavus sinh c t tr c ó.
Cotty ã có nh ng ánh giá s b v t l m c nhi m trên qu bông khi gây nhi m i hai ch ngA. flavus sinh c và không sinh c. K t qu cho bi t, ch ng AF36 không c ã chi m u th tr c ch ng c AF13. Ch ng AF36 xu t hi n h n 70% trên các m u t bông nhi m m c. T ng ng v i nó, hàm l ng aflatoxin c ng gi m i, th p nh t là gi m 82%, nhi u nh t là gi m 100%. Trong khi ó, ch ng c AF13 b kìm hãm, có m t trên không quá 33% s m u [44].
Tuy nhiên, c ng chính các nghiên c u c a Cotty ch ra r ng, không ph i ch ng nào ng có kh n ng i kháng n nh. M t ch ng có th th hi n n ng l c c nh tranh t t trên môi tr ng nhân t o, nh ng khi tri n khai trên môi tr ng t nhiên l i không gi c tính ch t ó. Ví d , ch ng A. flavus NRRL5918 gi m 98% aflatoxin khi nuôi trên môi tr ng nhân t o, nh ng khi nuôi trên qu bông l i t ng l ng aflatoxin lên 24%. M t s ch ng khác có th m t kh n ng i kháng sau nhi u l n c y chuy n [45]. Do ó, mu n có
t ch ph mA. flavus không sinh aflatoxin t t thì công n nghiên c u và th nghi m ngoài ng ru ng óng vai trò h t s c quan tr ng.
1.5.2 ánh giá hi u qu c a ch ph mA. flavus không sinh aflatoxin quy mô ng ru ng
Sau khi c nghiên c u th nghi m k trong phòng thí nghi m và nhà kính, ch ph m s c áp d ng lên cây tr ng trong u ki n t nhiên. Ban u là quy mô nh ti p t c kh o sát ánh giá, sau ó là tri n khai trên di n r ng. Vi c nghiên c u trong u ki n t nhiên s a ra k t qu trung th c nh t v kh n ng i kháng c a ch ph m, quy t nh có nên a vào ng d ng i trà hay không.
Brown và c ng s ã th nghi m ch ph m n m i khángA. flavus trên ngô c tr ng New Orleans, LA (M ). Trong nh ng thí nghi m này, Brown chú ý n nh h ng a th i m s d ng ch ph m n hi u qu gi m aflatoxin. Nh ng b p ngô c c y ch ng sinh aflatoxin và không sinh aflatoxin, hàm l ng aflatoxin gi m g n 80%. Hi u qu gi m nhi m t ng cao n 94,6% khi ch ng không c c y tr c ch ng sinh c 24 gi
[27]. K t qu này là t ng ng v i nh ng nghiên c u trong phòng thí nghi m. Khi ch ng không c chi m c u th tr c thì hi u qu gi m aflatoxin s r t cao.
Vào các n m 1989 và 1990, Cotty ã ánh giá hi u qu gi m aflatoxin c a ch ngA. flavus AF36 trên bông c tr ng Yuma, Arizona (M ). K t qu cho th y, trong c hai m, h t bông c x lý ch ph m AF36 u nhi m aflatoxin ít h n. Hàm l ng aflatoxin B1 gi m 75% – 82% vào n m 1989 và gi m 99,6% vào n m 1990. C ng trong thí nghi m này, khi s d ng ch ph m AF36, t l A. flavus nhi m trên cây bông có s thay i áng , n m 1989 t l nhi mA. flavus trên cây là 67% và n m 1990 là 100%. N m 1990 t l nhi mA. flavus trên b m t h t bông là 75%. S l ngA. flavus trên h t bông thu c khi
a b ng Triton X-100 0,01% là 23949 bào t /g h t (1990). T l AF36 càng cao thì hi u qu gi m aflatoxin càng cao. Khi không có m t AF36, hàm l ng aflatoxin B1 trên h t bông là g n 70 g/g. Không phát hi n th y aflatoxin B1 trên h t bông khi t l AF36 t
n 90% [43].
Hình 1.6 Hàm l ng aflatoxin trên h t bông gi m khi t l AF36 t ng
Australia, Pitt ã th nghi m ch ph m n m i khángA. flavus vàA. parasiticus
trên cây l c 05 trang tr i. K t qu , hàm l ng aflatoxin trên c gi m 75 – 98% t ng ng v i s có m t c a ch ng n m i kháng t 97 – 98% t ng s ch ng m c. D ng nh không nh n th y s thuyên gi m aflatoxin khi ch ng không c ch chi m 88% t ng s ch ng m c. Pitt ã k t lu n r ng, hi u qu gi m nhi m aflatoxin ch t c khi ch ng không c chi m t 90% t ng s ch ng m c tr lên, t t h n là 95% hay cao h n n a [108].
1.5.3 ánh giá tác ng c a ch ph m
t ch ph m n m i kháng không n thu n ch có hi u qu gi m nhi m aflatoxin mà nó còn ph i áp ng m t s tiêu chu n khác. Ch ph m ph i không gây h i cho con ng i và môi tr ng, không ti m n nguy c d n n tuy t ch ng loài… Do ó, vi c ánh giá tác ng c a ch ph m lên s c kh e con ng i, môi tr ng thiên nhiên, s bi n ng
a h sinh thái là vi c làm h t s c c n thi t.
Tr c tiên, ch ph m c ánh giá r i ro trên ng v t th nghi m trong phòng thí nghi m. ng v t th nghi m là các lo i ng v t có vú nh th , chu t nh t, chu t lang… Gây nhi m cho ng v t thí nghi m qua ng n u ng ho c ng hít th . Ti n hành thí nghi m c tính c p và ki m tra tr ng di n trên ng v t thí nghi m, so sánh v i ng
t i ch ng k t lu n c tính c a ch ph m.
quan B o v Môi tr ng c a M ã nghiên c u nh h ng c a ch ph m AF36 ch ng A.flavus AF36 cho th y, AF36 không gây c qua ng mi ng hay ph i v i ng v t có vú. Trong sáu n m nghiên c u, s n xu t và th nghi m, không có báo cáo v các tr ng h p d ng hay tác d ng ph c a ch ph m trên ng i.
Thông th ng, các nguy c gây r i ro cho môi tr ng c C quan B o v môi tr ng ánh giá. Ch ph m AF36 c C quan B o v môi tr ng M (EPA) ch ng nh n không gây c lên ng v t nh chim và ong m t. Trong thí nghi m tiêm ch ph m n m vào ph i c a m t loài chim cút không th y xu t hi n tác d ng ph . Ch ph m c ng không gây tác d ng ph khi ti p xúc v i côn trùng, cá và các lo i ng v t khác, bao g m c ng t hoang dã. EPA ã k t lu n r ng, ch ph m n m i kháng AF36 không có h i hay ti m n nguy c gây tuy t ch ng loài [127].
Các nhà nghiên c u c a b khoa h c M ã ánh giá s nguy hi m c a ch ngA. flavusNRRL21882 i v i s c kh e con ng i. K t qu cho th y, không có tác d ng x u i v i s n xu t c ng nh nhân dân xung quanh vùng s d ng ch ph m A. flavus
NRRL21882 trên cây tr ng. Các nghiên c u trong phòng thí nghi m ã ch ra r ng ch ph m A. flavus NRRL21882 không gây c và gây b nh ng ph i, ng u ng trên chu t nh t. Nh ng nghiên c u này ã cho th y, c ng A. flavus NRRL21882 ã không ng sót các mô c a chu t nh t. Nh v y, ch ng này không gây c i v i ng v t có vú. Trong quá trình nghiên c u phòng thí nghi m và th nghi m ngoài ng trên 10 m, không có nhân viên nào thông báo các tác d ng có h i do làm vi c v i ch ng A. flavus NRRL21882 [118]. Không có báo cáo v nhi m c môi tr ng do s d ng ch
ph m vi sinh v t này, c ng nh tác d ng c v i ng v t có vú, các loài chim, ong, các côn trùng không có h i hay v i các loài th c v t. Nh ng nghiên c u c ng ch ra ch ngA. flavusNRRL21882 ã s m tr v m c n n sau quá trình x lý các cánh ng l c. K t qu nghiên c u ti p t c c ng cho th y NRRL21882 không có h i i v i sinh v t th y sinh.
Khi a ch ph m ra ng ru ng, ch c ch n nó s nh h ng n h vi sinh v t có n trong t hay trên cây tr ng. c bi t, t l các lo i n m m c s có nh ng s bi n ng nh t nh. u này c ch ra trong công b c a Cotty khi ông nghiên c u trên t tr ng bông. H n m m cA. flavus trong t tr ng bông c Cotty kh o sát trong hai n m 1989, 1990 tr c và sau khi s d ng ch ph m AF36. M t A. flavus trong t tr c khi bón ch ph m là 7822 bào t /g (1989), 1583 bào t /g (1990), sau khi bón ch ph m là 48217 bào t /g (1989) và 55858 bào t /g (1990). Cùng v i ó là s t ng t l ch ng AF36, t 0% tr c khi bón lên 69% sau khi s d ng ch ph m [43].
Khi a ra ng ru ng, ch ng A.flavus không sinh aflatoxin s thay th cho các ch ng sinh aflatoxin, k t qu t l A.flavus sinh aflatoxin gi m, ch ng không sinh aflatoxin ng, cùng v i s gi m l ng aflatoxin. Tuy nhiên, nh h ng c a ph ng pháp x lý t ra ngoài c ph m vi th nghi m. Nguyên nhân là do s phát tán t nhiên c a ch ng n m
i kháng nh gió, côn trùng hay ng v t t v trí này sang trí khác.
1.5.4 Các y u t nh h ng n hi u qu ch ph m
Li u l ng s d ng:Li u l ng s d ng là m t trong nh ng y u t quan tr ng nh ng n hi u qu c a ch ph m. T l bào t c a ch ng không sinh aflatoxin c bón vào t ph i t o c u th c nh tranh c ch ch ng sinh aflatoxin t nhiên. M t vài thí nghi m ã c ti n hành xác nh nh h ng c a li u l ng s d ng n m c
nhi m aflatoxin trên l c tr c và sau thu ho ch.
M , hai ch ngA. flavus NRRL21368 vàA. parasiticus NRRL6111 c s d ng i li u l ng khác nhau trên l c vào n m 1994. Ch ph m c bón v i các l ng 0, 2, 10, và 50g/m chi u dài lu ng l c. Khi phân tích, hàm l ng aflatoxin trên h t l c t ng