1. 1T NG QUA NV AFLATOXIN
3.2.1 Nghiên cu công ngh nuôi c yb mt sn x ut bà ot ch ng A.flavus DA
flavus DA2 quy mô phòng thí nghi m
có th s n xu t c l ng l n bào t n m A. flavus DA2 ph c v cho nghiên u và làm ti n cho s n xu t ch ph m n m i kháng sau này quy mô công nghi p, các y u t nh h ng n quá trình sinh tr ng t o bào t c a ch ng A. flavus DA2 ã c kh o sát. M t trong nh ng y u t nh h ng nhi u nh t là môi tr ng dinh d ng, nhi t , th i gian và hàm m c a môi tr ng nuôi c y.
3.2.1.1 Xây d ng ng cong sinh tr ng c a ch ng A. flavus DA2
i m c ích xác nh th i m thích h p thu nh n sinh kh i gi ng l ng cho các nuôi k ti p, ch ng th nghi mA. flavus DA2 c nuôi nuôi c y nhi t 300C, pH = 5,5, t c khu y c nh 200 vòng/phút trên môi tr ng khoai tây, trong bình tam giác. Sau m i 12h nuôi, m u c l y ra, l c, thu h s i n m và s y khô n kh i l ng không i nhi t 1050C. K t qu c trình bày trên hình 3.8
Hình 3.9 ng cong sinh tr ng c a ch ng A. flavus DA2
Th i gian (h) n g sinh kh i (g/ l)
t qu hình 3.9 cho th y, hàm l ng sinh kh i ch ngA. flavus DA2 ph thu c ch t ch vào th i gian và t ng d n theo th i gian nuôi c y. gi th 12, sinh kh i t 1,5g/lít và t cao nh t sau 48 gi nuôi c y là 8,1g/l trên môi tr ng d ch th khoai tây. Sau 48gi nuôi c y, s n l ng sinh kh iA. flavus DA2 gi m d n. Nh v y có th nói th i gian nhân nuôi thích h p cho thu h i sinh kh i ch ngA. flavus DA2 là 48 gi , vì khi ti p t c kéo dài th i gian nhân nuôi s x y ra hi n t ng thi u dinh d ng và trên thành bình có t o bào t , sinh kh i n m m c gi m. K t qu nghiên c u này phù h p v i k t qu c a Jafari và c ng , thu sinh kh i m c khi nuôi c y trong môi tr ng l ng thì t kho ng th i gian là 3 n 5 ngày nuôi c y s cho s n l ng sinh kh i m c cao nh t. Tuy nhiên m t s ch ng công nghi p ti m n ng có th c nuôi c y qui mô l n ch kho ng 2-3 ngày [88]. Vì
y, th i i m c y chuy n thích h p c a ch ngA. flavus DA2 là 2 ngày.
3.2.1.2 L a ch n môi tr ng thích h p
Có th nói, l a ch n môi tr ng nuôi c y cho s n l ng bào t A. flavus DA2 cao là t quan tr ng, có ý ngh a th c ti n khi ng d ng s n xu t ch ph m quy mô l n. Ch ng
A. flavus DA2 c nuôi c y b m t u ki n nhi t 300C, pH 5,5 hàm m 65%, t l gi ng 10% trên 4 môi tr ng khác nhau trong các bình tam giác g m: môi tr ng cám tr u (MT1), g o (MT2), b t ngô (MT3) và ngô h t (MT4) ây là các môi tr ng r t s n có và r ti n. Sau 7 ngày nuôi c y thu h i bào t , s y khô nhi t 450C sau 24 gi xác nh m t
bào t . K t qu c trình bày b ng 3.11.
ng 3.11 t bào t c a ch ng A. flavus DA2 t o c trên các môi tr ng khác nhau
STT Môi tr ng nuôi c y t bào t x 107 (CFU/g) 1 MT1 7,15 ± 0,21a 2 MT2 5,04 ± 0,17b 3 MT3 4,57 ± 0,12c 4 MT4 3,07 ± 0,15d CV(%) 2,45 LSD0,05 0
(Trong cùng m t c t, các k t qu có cùng ít nh t m t ch gi ng nhau thì không có ý ngh a khác nhau t i p < 0,05)
t qu b ng 3.11 cho th y môi tr ng MT1 (môi tr ng cám tr u) thích h p cho s phát tri n và t o bào t c a ch ng A. flavus DA2. môi tr ng này m t bào t A. flavus DA2 t 7,1x107CFU/g sau 7 ngày nuôi c y. Book và Cotty ã nghiên c u công ngh s n xu t bào t ch ngA. flavus không sinh c t trên môi tr ng h t lúa mì, sau 7 ngày nuôi c y nhi t 310C s n l ng bào t t 4,9x109CFU/g [25]. M c dù, môi tr ng cám tr u cho m t bào t th p h n môi tr ng h t lúa mì nh ng môi tr ng cám tr u có giá thành r h n nhi u so v i môi tr ng h t lúa mì và là ngu n nguyên li u s n có Vi t Nam, r t thu n l i khi ng d ng s n xu t bào t ch ng A. flavus DA2 quy mô pilot. Chính vì nh ng lý do trên, môi tr ng cám tr u MT1 c s d ng cho các nghiên
u ti p theo.
3.2.1.3 nh h ng c a nhi t nuôi c y
Nhi t óng vai trò ch y u trong s sinh tr ng c a s i n m và tác ng n vi c n sinh bào t c ng nh s n y m m c a chúng.A.flavus là lo i n m m c a nhi t có th sinh tr ng và phát tri n gi i nhi t 20-600C. Nhi t thích h p là 25-350C. N u nhi t
xu ng d i 240C n m m c phát tri n ch m, sinh bào t y u, th i gian nuôi c y kéo dài [2]. Trong nghiên c u này, ch ngA. flavus DA2 c c nuôi c y trên môi tr ng cám tr u t l 4:1, pH =5,5, m 65%, l ng gi ng ban u 10% v i các kho ng nhi t trong kh i thay i l n l t là: 24, 26, 28, 30, 32 và 340C. Kh n ng t o bào t c a ch ng
A. flavus DA2 các u ki n nhi t khác nhau c trình bày trong b ng 3.12.
ng 3.12Kh n ng t o bào t c a ch ng A. flavus DA2 các nhi t nuôi c y khác nhau
STT Nhi t (0C) t bào t x107 (CFU/g)
1 24 1,31 ± 0,15e 2 26 4,25 ± 0,67c 3 28 5,80 ± 0,29b 4 30 7,1± 0,19a 5 32 5,52 ± 0,54b 6 34 2,7 ± 0,26d CV(%) 2,23 LSD0,05 0,96
(Trong cùng m t c t, các k t qu có cùng ít nh t m t ch gi ng nhau thì không có ý ngh a khác nhau t i p < 0,05)
t qu b ng 3.12 cho th y, ch ngA. flavus DA2 có kh n ng t o bào t cao nh t là 7,1x107CFU/g t i 300C sau 7 ngày nuôi c y. Khi nuôi c y nhi t 24 và 340C, m t bào t c a ch ngA. flavus DA2 gi m, u này có th do nhi t th p ho c cao kìm hãm kh n ng sinh tr ng, phát tri n sinh kh i n m và ã làm gi m kh n ng t o bào t n m. Theo Nguy n Lân D ng và c ng s , nhi t thích h p v i a s n m m c là 30-32oC[8]. t qu này c ng phù h p v i nghiên c u c a Book và Cotty khi nuôi c yA.flavus AF36 nhi t 310C m t bào t t 4,9x109CFU/g sau 7 ngày nuôi c y [25]. t qu thí nghi m cho th y, nhi t thích h p nuôi c y ch ngA.flavus DA2 cho s t o bào t là 300C.
3.2.1.4 nh h ng c a m c a môi tr ng.
nghiên c u nh h ng c a m môi tr ng nuôi c y n kh n ng t o bào t , ch ngA. flavus DA2 c nuôi c y trên môi tr ng cám tr u, pH=5,5 v i m ban u khác nhau thay i trong kho ng t 55%-75%. K t qu c trình bày b ng 3.13
ng 3.13 nh h ng c a m môi tr ng n kh n ng t o bào t c a ch ng A. flavus DA2
STT m (%) M t bào t x107 (CFU/g) 1 55 2,4 ± 0,17d 2 60 5,7 b 3 65 7,1a 4 70 4,3 c 5 75 2,0 e CV(%) 2,31 LSD0,05 0
(Trong cùng m t c t, các k t qu có cùng ít nh t m t ch gi ng nhau thì không có ý ngh a khác nhau t i p < 0,05)
t qu b ng 3.13 cho th y, khi t ng m t 55% n 65%, kh n ng t o bào t a ch ngA. flavus DA2 t ng d n và t giá tr c c i là 7,1x107CFU/g khi m môi tr ng cám tr u là 65%. các giá tr m môi tr ng cám tr u cao h n, kh n ng t o bào t c a ch ngA.flavus DA2 gi m d n. K t qu này phù h p v i c m sinh lý chung a n m m c th ng sinh tr ng và có ho t tính sinh h c t t trên môi tr ng r n có m 60 – 65% [2].
3.2.1.5 Xác nh th i gian thu h i bào t c a ch ng A.flavus DA2.
Th i gian nuôi c y có nh h ng l n n sinh tr ng, phát tri n c a n m m c, là u t công ngh quan tr ng trong vi c s n xu t các ch ph m sinh h c. N u k t thúc s m quá trình nuôi c y, thì s n l ng bào t ch a t t i a, n u k t thúc mu n thì nh h ng n ch t l ng và làm t ng chi phí trong s n xu t. Nh m tìm ra th i gian nuôi c y thích p cho thu h i bào t n m cao, ch ngA.flavus DA2 c nuôi trên môi tr ng cám tr u i pH = 5,5, nhi t 300C và xác nh m t bào t sau các kho ng th i gian nuôi c y khác nhau. K t qu c trình bày b ng 3.14.
ng 3.14Th i m thu bào t c a ch ng A. flavus DA2
STT Th i gian nuôi c y
(ngày)
t bào t (CFU/g)
1 1-3 Ch có s i n m phát tri n, không có bào t nhìn th y ng m t th ng 2 4 1,2x 104 g 3 5 2,4x 105 d 4 6 5,2x 106 c 5 7 7,1x 107 b 6 8 7,9x 108 a 7 9 2,0x109 e 8 10 2,2x 109 f CV(%) 2,18 LSD0,05 173E-9
t qu b ng 3.14 cho th y, m t bào t ch ngA.flavus DA2 nuôi c y trên môi tr ng cám tr u t ng nhanh trong kho ng th i gian t 4-8 ngày. Ngày th 9 m t bào t
t 2,0x109CFU/g và t cao nh t ngày th 10, là 2,2x109 CFU/g. Nh v y, có th nói th i gian nuôi c y phù h p cho s t o bào t ch ngA.flavus DA2 là 9 ngày. N u kéo dài th i gian nuôi c y n ngày th 10 thì s làm t ng chi phí trong s n xu t, trong khi s n ng bào t A.flavus DA2 t ng lên không nhi u. K t qu này c ng phù h p v i nghiên
u c a Cotty và c ng s khi nuôi c y ch ng A.flavus AF36 không sinh c t trên môi tr ng cám lúa m , m t bào t t ng nhanh trong kho ng 3-7 ngày, t 4,9x109CFU/g sau 7 ngày nuôi c y. T ngày th 10 n ngày th 14 m t bào t t ng ch m, sau 14 ngày nuôi c y m t bào t t cao nh t 6,5x109CFU/g [25].
k t qu nghiên c u trên có th a ra u ki n công ngh nhân nuôi b m t c a ch ngA.flavus DA2 nh sau: ch ng n m c t ng sinh trên môi tr ng PDA l ng nhi t 30oC, t c l c 200v/phút, sau 48 gi thu h i sinh kh i h s i phân ph i lên môi tr ng b m t v i t l gi ng 10%. Ch ngA.flavus DA2 cho kh n ng t o bào t cao trên môi tr ng cám tr u (t l 4:1) nhi t nuôi c y 300C, pH 5,5, m 65%, sau 9 ngày nuôi c y m t bào t t 2,0x109CFU/g.