1. 1T NG QUA NV AFLATOXIN
3.1.3 Phân l oi các ch ng Aspergillusflavus không sinh aflatoxin phân lp c
ã sàng l c c 21 ch ngA. flavus không sinh aflatoxin dùng cho các thí nghi m ti p sau. t qu phân tích c ng ch ra r ng 70,5% s ch ng phân l p c có kh n ng t o aflatoxin dao ng t 80-600 ppb các vùng kh o sát. Theo nghiên c u c a Abbas và ng s ã công b , 84% các ch ngA. flavus phân l p t ngô bang Missisibi, M có kh ng t o aflatoxin [19]. Pháp ch có 25% ch ngA. flavus phân l p t l ng th c có kh ng sinh aflatoxin [2]. N m 1990, theo m t nghiên c u khác c a Siriacha và c ng s thì kh n ng t o c t aflatoxin c a các ch ngA.flavus phân l p t ngô Thái Lan dao ng t 2461ppb n 32446 ppb [121]. K t qu khác bi t trên cho phép k t lu n: t l các ch ngA. flavus vùng nhi t i có kh n ng t o aflatoxin cao h n các ch ng vùng ôn i. Các y u t sinh thái nh nhi t , m, u ki n t ai…có vai trò quan tr ng trong vi c xu t hi n các ch ngA. flavus sinh aflatoxin.
nhi mA. flavus có kh n ng t o aflatoxin v i t n su t cao trên ngô, l c các t nh c kh o sát là m t s li u khoa h c quan tr ng trong vi c khuy n cáo và xây d ng ch ng trình phòng ch ng n m m c và c t aflatoxin trên ngô, l c Vi t Nam. Nh ng li u này c ng cho th y, c n có bi n pháp hi u qu , an toàn phòng ch ng c ng nh n ki m tra ch t ch m c nhi m c t này trên nông s n.
3.1.3 Phân lo i các ch ng Aspergillus flavus không sinh aflatoxin phân l pc c
xác nh chính xác các ch ng không sinh aflatoxin có ph i là Aspergillus flavus
không, các ch ng A. flavus phân l p c phân lo i theo khóa phân lo i c a Raper và Fennell The genus Aspergillus . ây là tài li u kinh n dùng trong phân lo i các loài m m c thu c chiAspergillus. Theo khóa phân lo i c a Raper và Fennell loàiAspergillus flavuscó các c m c u trúc vi h c nh sau: u bào t có d ng t a tròn, ng kính kho ng 200-750µm. Cu ng bào t có thành dày, không m u, s n sùi, th ng dài 1µm. ng nh giá có hình c u hay hình g n c u, ng kính kho ng 25-60µm. Th bình 01 ho c 02 t ng, ôi khi có c hai ki u th bình ngay trong m t u. Bào t tr n có hình c u ho c hình c u, s n sùi h c có gai, kích th c 2,5-6 µm [1, 114].
c m hình thái và c u trúc vi h c c a 21 ch ngA. flavuskhông sinh aflatoxin và t ch ngA. flavussinh aflatoxin cao nh t (ký hi u là AF14) c trình bày các b ng 3.3a, 3.3b, 3.4a và 3.4b.
ng 3.3a c m hình thái c a các ch ng Aspergillus flavus phân l p t các m u ngô, l c STT Ký hi u Ch ng ng kính khu n l c (cm) u s c khu n l c D ng m t khu n l c 1 DA1 6,0-7,5 u vàng xanh lá cây; t trái khu n l c có m u nâu h ng; không có s c t hòa tan quanh khu n l c;
Bông x trung tâm và rìa ngoài khu n l c có d ng nhung,
2 DA2 6,5-7,5
u vàng xanh lá cây; t trái khu n l c có m u nâu; không có s c t hòa tan quanh khu n l c
Bông x trung tâm và rìa ngoài khu n l c có d ng nhung,
3 DA3 4,0-5,0
u vàng xanh lá cây; t trái khu n l c có m u nâu; không có s c t hòa tan quanh khu n l c
Bông x trung tâm và rìa ngoài khu n l c có d ng nhung,
4 AL21 6,0-7,0
u vàng xanh lá cây; t trái khu n l c có m u nâu; không có s c t hòa tan quanh khu n l c
Bông x trung tâm và rìa ngoài khu n l c có d ng nhung,
5 AL22 6,0-7,0
u vàng xanh lá cây; t trái khu n l c có m u nâu; không có s c t hòa tan quanh khu n l c
Bông x trung tâm và rìa ngoài khu n l c có d ng nhung,
6 AL23 5,0-7,0
u vàng xanh lá cây; t trái khu n l c có m u nâu; không có s c t hòa tan quanh khu n l c
Bông x trung tâm và rìa ngoài khu n l c có d ng nhung,
7 N9 3,0-5,0
u vàng xanh lá cây; t trái khu n l c có m u nâu; không có s c t hòa tan quanh khu n l c
Bông x trung tâm và rìa ngoài khu n l c có d ng nhung,
8 NA7 4,0-5,0
u vàng xanh lá cây; t trái khu n l c có m u nâu; không có s c t hòa tan quanh khu n l c
Bông x trung tâm và rìa ngoài khu n l c có d ng nhung,
9 NA9 5,0-6,0
u vàng xanh lá cây; t trái khu n l c có m u nâu; không có s c t hòa tan quanh khu n l c
Bông x trung tâm và rìa ngoài khu n l c có d ng nhung,
10 VP3 3,5-4,6
u vàng xanh lá cây; t trái khu n l c có m u nâu; không có s c t hòa tan quanh khu n l c
Bông x trung tâm và rìa ngoài khu n l c có d ng nhung,
11 NA10 3,0-5,0
u vàng xanh lá cây; t trái khu n l c có m u nâu; không có s c t hòa tan quanh khu n l c
Bông x trung tâm và rìa ngoài khu n l c có d ng nhung,
12 HN9 4,0-6,0
u vàng xanh lá cây; t trái khu n l c có m u nâu; không có s c t hòa tan quanh khu n l c
Bông x trung tâm và rìa ngoài khu n l c có d ng nhung,
ng 3.3b c m hình thái c a các ch ng A. flavus phân l p t các m u ngô, l c STT Ký hi u Ch ng ng kính khu n l c (cm) u s c khu n l c ng m t khu n l c 13 A3 3,0-4,0
u xanh lá cây, không có s c t hòa tan quanh khu n l c; M t trái khu n
c có m u nâu h ng;
Bông x trung tâm và rìa ngoài khu n l c có d ng nhung,
14 A5 5,0-6,0
u vàng xanh lá cây; t trái khu n l c có m u nâu; không có s c t hòa tan quanh khu n l c
Bông x trung tâm và rìa ngoài khu n l c có d ng nhung,
15 NA1 4,0-5,0
u vàng h i l c; M t trái khu n l c có m u nâu; không có s c t hòa tan quanh khu n l c.
Bông x trung tâm và rìa ngoài khu n l c có d ng nhung,
16 NA2 3,0-5,0
u vàng xanh lá cây; t trái khu n l c có m u nâu; không có s c t hòa tan quanh khu n l c
Bông x trung tâm và rìa ngoài khu n l c có d ng nhung,
17 NA3 3,0-5,0
u vàng xanh lá cây; t trái khu n l c có m u nâu; không có s c t hòa tan quanh khu n l c
Bông x trung tâm và rìa ngoài khu n l c có d ng nhung,
18 VP1 4,0-6,0
u vàng xanh lá cây; t trái khu n l c có m u nâu; không có s c t hòa tan quanh khu n l c, rìa khu n l c có m u tr ng
n
Bông x trung tâm và rìa ngoài khu n l c có d ng nhung,
19 VP2 3,5-5,0
u vàng xanh lá cây; t trái khu n l c có m u nâu; không có s c t hòa tan quanh khu n l c
Bông x trung tâm và rìa ngoài khu n l c có d ng nhung. 20 VP3 3,0-4,5 u vàng xanh lá cây; t trái khu n l c có m u nâu h ng; không có s c t hòa tan quanh khu n l c, rìa khu n l c có m u tr ng m n
Bông x trung tâm và rìa ngoài khu n l c có d ng nhung,
21 VP4 5,5-6,0
u vàng xanh lá cây; t trái khu n l c có m u nâu; không có s c t hòa tan quanh khu n l c, rìa khu n l c có m u tr ng
n
Bông x trung tâm và rìa ngoài khu n l c có d ng nhung, 22 AF14 (ch ng sinh aflatoxin) 5,5-7,0 u vàng xanh lá cây; t trái khu n l c có m u tím nh t; không có s c t hòa tan quanh khu n l c, rìa khu n l c có m u tr ng m n
Bông x trung tâm và rìa ngoài khu n l c có d ng nhung,
49
ng 3.4a c m c u trúc vi h c c a các ch ng A. flavus phân l p t các m u ngô, l c
Bào t tr n ng nh giá Cu ng sinh bào t
STT Ký hi u Ch ng hàng th bình Hình d ng ng kính (µm) Hình d ng ng kính (µm) Hình d ng ng kính (µm)
1 DA1 1-2 Hình c u, có gai 4,0 - 6,0 Hình c u hay g u c u 25,5 - 36,5 n sùi 200 - 450
2 DA2 1-2 Hình c u, có gai 4,5 - 5,5 Hình c u hay g u c u 25,0 - 30,0 n sùi 200 - 400 3 DA3 1-2 Hình c u, có gai 2,5 - 4,5 Hình c u 30,0 - 40,0 n sùi 380 - 720 4 AL21 1-2 Hình c u, có gai 3,0 - 4,5 Hình c u 30,0 - 38,0 n sùi 450 - 700 5 AL22 1-2 Hình c u, có gai 2,5 - 3,8 Hình c u 35,0 - 40,0 n sùi 460 - 680 6 AL23 1-2 Hình c u, có gai 3,0 - 4,8 Hình c u 25,0 - 35,0 n sùi 400 - 600
7 N9 1-2 Hình c u hay g n
u, có gai 3,0 - 4,0 Hình c u hay chu 36,5 - 40,0 n sùi 320 - 550
8 NA7 1-2 Hình c u hay g n
u, có gai 3,0 - 3,5
Hình g n c u hay
chu 35,0 - 40,0 n sùi 360 - 500
9 NA9 1-2 Hình c u hay g n
u, có gai 3,0 - 3,5 Hình c u hay chu 35,0 - 45,0 n sùi 300 - 500
10 VP3 1 Hình c u, có gai 2,5 - 3,0 Hình g n c u hay
50
ng 3.4b c m c u trúc vi h c c a các ch ng A. flavus phân l p t các m u ngô, l c
Bào t tr n ng nh giá Cu ng sinh bào t
STT Ký hi u Ch ng A.flavus hàng th bình Hình d ng ng kính (µm) Hình d ng ng kính (µm) Hình d ng ng kính (µm)
11 NA10 1 Hình c u, có gai 2,5 - 3,5 Hình g n c u hay chu 35-50 n sùi 270 - 550
12 HN9 1-2 Hình c u, có gai 3,5 - 6,0 Hình c u 40-50 n sùi 600 - 750
13 A3 1-2 Hình c u, có gai 3,7 - 6,0 Hình g n c u hay chu 36 - 60 n sùi 430 - 750 14 A5 1-2 Hình c u hay g n
u, có gai
3,0 -5,5 Hình c u 37-52 n sùi 450 - 700
15 NA1 1-2 Hình c u 3,0 -5,0 Hình c u 19 - 45 n sùi 340 - 450
16 NA2 1-2 Hình c u 3,0 -4,5 Hình g n c u hay chu 25 - 40 n sùi 300 - 470 17 NA3 1-2 Hình c u 3,5-4,5 Hình g n c u hay chu 30 - 40 n sùi 320 - 450 18 VP1 1-2 Hình c u 3,0 -5,5 Hình g n c u hay chu 25 - 60 n sùi 300 - 480 19 VP2 1-2 Hình c u 2,5 -5,0 Hình g n c u hay chu 21 - 50 n sùi 250 - 450 20 VP3 1-2 Hình c u 2,7-4,5 Hình g n c u hay chu 30 - 65 n sùi 300 - 420 21 VP4 1-2 Hình c u 2,5-4,0 Hình g n c u hay chu 30 - 65 n sùi 400 - 650
22 AF14
(ch ng sinh aflatoxin)
ng 3.3a, 3.3b, 3.4a và 3.4 b mô t c m hình thái và c u trúc vi h c c a các ch ngA. flavus không sinh aflatoxin và ch ngA. flavus AF14 sinh aflatoxin cao nh t phân p c. K t qu cho th y, trong kho ng 7 ngày nuôi c y trên môi tr ng Czapek nhi t 28oC, các khu n l cA. flavus có ng kính 3-7,5cm. S i n m t th a n dày, có n p nh n và mép r ng c a g n mép khu n l c. Khu n l c màu xanh lá cây - vàng. M t d i khu n l c th ng có m u nâu, nâu h ng ho c tím nh t ch y theo hình phóng x . Khu n l c không i m u sang nâu khi già, ây là m t c m hình thái quan tr ng phân bi t loài
Aspergillus flavus v i loàiAspergillus oryzae là loài có khu n l c m u xanh lá cây vàng nh ng i m u sang nâu khi già. Aspergillus oryzae là loài không sinh aflatoxin v n c dùng trong công ngh ch bi n th c ph m. u bào t có d ng t a tròn, ng kính kho ng 200-750µm. Cu ng bào t có thành dày, không m u, s n sùi. B ng nh giá có hình c u hay hình g n c u, ng kính kho ng 25-60µm. Th bình 01 ho c 02 t ng, ôi khi có c hai ki u th bình ngay trong m t u. Bào t tr n có hình c u ho c hình c u, s n sùi h c có gai, kích th c kho ng 2,5-6 µm.
i chi u v i các c m hình thái và c u trúc vi h c c a loàiA. flavus ã c Rapper và Fennell miêu t trong khóa phân lo i The genus Aspergillus chúng tôi th y 21 ch ngA. flavus phân l p c u thu c loàiAspergillus flavus.
3.1.4 Tuy n ch n các ch ngA. flavus không sinh aflatoxin
Theo nghiên c u c a nhi u tác gi trên th gi i, hi u qu gi m aflatoxin ph thu c vào t l gi a ch ngA .flavus không sinh v i ch ng sinh aflatoxin. T l này càng cao thì hi u qu gi m aflatoxin càng l n [44, 130]. Các ch ngA. flavus không sinh aflatoxin m c tiêu ph i có t c phát tri n nhanh chi m u th v s l ng thì m i có kh n ng i kháng cao v i các ch ngA. flavus sinh aflatoxin. Trên c s ó, d a vào k t qu b ng 3.3a và 3.3b, 05 ch ngA. flavus không sinh aflatoxin có ng kính khu n l c cao nh t trên môi tr ng Czapek sau 7 ngày nuôi c y ã c ch n th c hi n các nghiên c u ti p theo. Các ch ng ó c ký hi u là DA1, DA2, AL21, AL22 và AL23.
kh ng nh kh n ng không sinh aflatoxin c a các ch ng tuy n ch n, 5 ch ng A. flavus DA1, DA2, AL21, AL22, AL23 và ch ng A. flavus AF14 sinh aflatoxin c nuôi y trên môi tr ng ngô sau ó ti n hành nh l ng aflatoxin b ng s c ký l ng cao áp.
ng 3.5 Kh n ng sinh aflatoxin B1 c a các ch ng A. flavus phân l p
TT Ch ng phân l p Ngu n và a m phân l p
n l ng aflatoxin B1(ppb)
1 A. flavus AF14 Ngô - V nh Phúc 600 ± 5 2 A. flavus DA2 Ngô - Hà N i KPH 3 A.flavus DA1 Ngô - Hà N i KPH 4 A. flavus AL21 c - Ngh An KPH 5 A. flavus AL22 c - Ngh An KPH 6 A. flavus AL23 c - c Nông KPH Chú thích: KPH : Không phát hi n c