17 M13R 5’-CAGGAAACAGCATTGAC-3’ Mồi giải trỡnh tự
2.2.7. Giải trỡnh tự DNA
* Mục đớch: Giải trỡnh tự DNA (DNA sequencing) là quỏ trỡnh xỏc lập và thu
nhận thành phần nucleotide của một phõn đoạn DNA cần nghiờn cứu.
Trong nghiờn cứu sử dụng kỹ thuật xỏc định trỡnh tự dideoxy chain termination method (kỹ thuật enzym) của Sanger, được sử dụng phổ biến trong nghiờn cứu sinh học phõn tử hiện nay [8], [106], [107].
* Nguyờn lớ: Kỹ thuật xỏc định trỡnh tự DNA dideoxy chain termination
method, sử dụng cỏc nucleotide khụng chứa nhúm 3’-OH tự do (dideoxy nucleotide triphosphat, dd-NTPs), để dừng ngẫu nhiờn phản ứng tổng hợp tạo ra cỏc đoạn DNA sợi đơn dài ngắn khỏc nhau và chỉ sai khỏc nhau một nucleotide [8], [107].
* Kỹ thuật: Trong nghiờn cứu, tiến hành giải trỡnh tự đoạn DNA cỏc gen: PB2,
PB1 và PA của virus cỳm A/H5N1, từ mẫu DNA plasmid tỏi tổ hợp chứa cỏc gen trờn, tại Phũng thớ nghiệm trọng điểm của Viện Cụng nghệ sinh học - Viện Hàn lõm Khoa học và Cụng nghệ Việt Nam, kết hợp gửi mẫu giải trỡnh tự so sỏnh đối chiếu tại Phũng thớ nghiệm của hóng Bioneer (Hàn Quốc).
Mỗi gen PB2, PB1 hay PA do cú kớch thước lớn (2,3 kb), được thực hiện giải trỡnh tự bằng 3 phản ứng.
Mỗi phản ứng giải trỡnh tự ở trờn chỉ sử dụng một trong cỏc mồi: . Mồi xuụi (M13F): 5’-GTAAAACGACGGCCAG-3’ hoặc . Mồi ngược (M13R): 5’-CAGGAAACAGCATTGAC-3’, hoặc . Mồi giữa giải trỡnh tự đặc hiệu với từng gen (Bảng 2.2).
- Sử dụng bộ kit giải trỡnh tự Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Mỹ) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Bảng 2.12. Thành phần phản ứng giải trỡnh tự DNA cỏc gen PB2, PB1 và PA của 6
biến chủng virus cỳm A/H5N1 nghiờn cứu
Tờn húa chất Thể tớch (àl)
Big Dye 3.1 1
DNA plasmid tỏi tổ hợp (~50ng/àl) 3
Mồi giải trỡnh tự (1pMol/àl) 3,2
Nước tinh khiết 3,8
Enhance (húa chất kớch hoạt) 2X 10
Tổng thể tớch 20
- Chu trỡnh nhiệt của kỹ thuật PCR trong giải trỡnh tự DNA cỏc gen PB2, PB1 và PA, của 6 biến chủng virus nghiờn cứu, được trỡnh bày ở bảng 2.13.
Bảng 2.13. Chu trỡnh nhiệt của kỹ thuật PCR trong giải trỡnh tự DNA cỏc gen PB2
PB1 và PA của 6 biến chủng virus cỳm A/H5N1 nghiờn cứu
Nhiệt độ Thời gian Chu kỳ
920C 05 phỳt 1
960C 30 giõy
30
500C 05 giõy
600C 06 phỳt
40C Nhiệt độ bảo quản sản phẩm
- Tinh sạch sản phẩm của phản ứng giải trỡnh tự bằng bộ kit: DyeEx 2.0 Spin Kit (QIAGEN Inc., Mỹ) (xem phụ lục 7).
Sản phẩm sau khi tinh sạch được đụng khụ và đọc trỡnh tự trờn mỏy tự động ABI-3100 Avant Genetics Analyzer (Mỹ), cú tại Viện Cụng nghệ sinh học - Viện Hàn lõm Khoa học và Cụng nghệ Việt Nam.