6 VỊ TRÍ SAI KHÁC NUCLEOTID E VỊ TRÍ THAY ĐỔI AMINO ACID
3.3.1. Kết quả phõn tớch xỏc định phả hệ nguồn gốc gen PB
Kết quả xõy dựng cõy phả hệ nguồn gốc dựa trờn 56 trỡnh tự nucleotide và amino acid gen PB2, của 6 biến chủng virus cỳm A/H5N1 nghiờn cứu và 50 chủng virus tham chiếu, được trỡnh bày trong hỡnh 3.8 và phụ lục 19, cho thấy:
* Cú sự phự hợp về phả hệ nguồn gốc dựa trờn cả trỡnh tự nucleotide và amino acid gen PB2, của 6 biến chủng nghiờn cứu và 50 chủng virus tham chiếu núi trờn.
* Gen PB2 của 6 biến chủng virus cỳm A/H5N1 nghiờn cứu cựng với cỏc chủng virus phõn lập từ 2003 – 2012, tập hợp thành 1 nhỏnh tiến húa cú quan hệ gần gũi với nhỏnh tiến húa gen tương ứng, của nhúm virus clade 0 thuộc genotype GD, bao gồm cả chủng virus nguyờn thủy A/Goose/Guangdong/1/1996 (Hỡnh 3.9).
* Nhỏnh tiến húa chứa tập hợp gen PB2 của cỏc chủng virus cỳm A/H5N1 phõn lập cỏc năm từ 2003 – 2012, lại cú sự chia tỏch thành 2 phõn nhỏnh khỏc nhau, tạm gọi là cỏc phõn nhỏnh 1 và 2 gen PB2 (Hỡnh 3.9).
Hỡnh 3.9. Cõy phả hệ nguồn gốc 56 chủng virus cỳm A/H5N1 dựa trờn trỡnh tự
nucleotide gen PB2 polymerase
Ghi chỳ: Cõy phả hệ được xõy dựng bằng chương trỡnh MEGA4.1 sử dụng phương phỏp liờn kết cận kề
(Neighbour – Joining, NJ) với hệ số bootstrap = 1000 replicates. Sỏu chủng virus cỳm A/H5N1 nghiờn cứu được in chữ đậm và kớ hiệu (◄); Kớ hiệu loài vật chủ: Dk(Duck): Vịt, BHG(Bar headed - goose): Ngỗng trời, MDk(Muscovy duck): Ngan; Ck(Chicken): Gà; Goose: Ngỗng; GCG(Greate crested grebe): Sếu đầu đỏ; Chủng virus phõn lập từ người bệnh kớ hiệu theo địa danh phõn lập, VN(VietNam): Việt Nam; CN(China): Trung Quốc; Anhui: An Huy; GuiZhou: Quý Chõu; Hubei: Hồ Bắc; Hunan: Hồ Nam; Gd(Guangdong): Quảng Đụng; QH(Qinghai): Quảng Hải; Gx(Guangxi): Quảng Tõy; Fujian: Phỳc Kiến; IN: Indonesia; ID(India): Ấn Độ; KH: Campuchia; MN(Mongola): Mụng Cổ; TH(Thailand): Thỏi Lan. Kớ hiệu số và chữ cỏi trong ngoặc đơn sau danh phỏp chủng: (clade H5-genotype) của chủng virus. Cỏc chữ cỏi Z, G, V và GD: tờn genotype (kiểu gen) virus cỳm A/H5N1; Tờn chủng virus đại diện nguồn gốc genotype được đúng khung.
+ Phõn nhỏnh 1 gen PB2 gồm cỏc chủng trong nhúm virus clade 1 thuộc genotype Z, và nhúm virus clade 1.1 cựng với một số chủng virus clade 2.3.2, 2.3.4, 2.1.3.2 thuộc genotype G và V, phõn lập tại Việt Nam, Thỏi Lan, Campuchia, Trung Quốc, Việt Nam và Indonesia từ năm 2003 – 2011. Phõn nhỏnh tiến húa trờn tiếp tục chia nhỏ hơn thành 4 dưới phõn nhỏnh khỏc nhau (Hỡnh 3.9). Trong đú:
- Gen PB2 của 2 biến chủng nghiờn cứu: CkDT382-2008, DkTG926-2009 và chủng A/MDk/VN/OIE/559/2011 clade 1.1 phõn lập tại Việt Nam năm 2011, tập hợp thành một dưới phõn nhỏnh với nhúm virus clade 1.1 phõn lập tại Campuchia từ 2007 – 2011. Dưới phõn nhỏnh này gồm chủng đại diện A/KH/R405050/2007 thuộc genotype Z, phõn lập từ người bệnh tại Campuchia năm 2007.
- Cũng như vậy, gen PB2 của nhúm virus clade 1 thuộc genotype Z phõn lập tại Việt Nam, Thỏi Lan cỏc năm 2003 – 2005, tập hợp thành một dưới phõn nhỏnh cú quan hệ gần gũi với gen tương ứng của chủng virus A/HK/212/2003 clade 1 thuộc genotype Z+, phõn lập từ người bệnh tại Hồng Kụng năm 2003 (Hỡnh 3.9).
- Ngoài ra, gen PB2 của 2 chủng virus: A/Fujian/1/2005 và A/Anhui/1/2005 clade 2.3.4 thuộc genotype V, 2 chủng virus: A/CN/Gd/01/2006 và A/Dk/Hunan/856/2006 clade 2.3.2 thuộc genotype V, cựng với một số chủng virus clade 2.3.2, 2.1.3.2 thuộc genotype G, phõn lập tại Trung Quốc, Việt Nam và Indonesia cỏc năm 2004 - 2006, tập hợp thành cỏc dưới phõn nhỏnh tỏch biệt so với 2 dưới phõn nhỏnh của nhúm virus clade 1 và 1.1 kể trờn (Hỡnh 3.9).
+ Phõn nhỏnh 2 gen PB2 gồm cỏc chủng trong 2 nhúm virus clade 2.3.4.3 và 2.3.2.1, cựng với một số chủng virus clade 2.2, 2.3.2, 2.3.4, 2.3.4.1, 2.3.4.2 thuộc cỏc genotype Z, G và V, phõn lập tại Việt Nam, Lào, Trung Quốc, Nhật Bản, Ấn Độ và Mụng Cổ cỏc năm từ 2005 - 2012. Phõn nhỏnh này cũng cú sự phõn chia thành 4 dưới phõn nhỏnh khỏc nhau (Hỡnh 3.9). Trong đú:
- Gen PB2 của 2 biến chủng virus DkQT801-2011 và DkQT802-2011 clade 2.3.2.1 nghiờn cứu, hợp thành một dưới phõn nhỏnh cựng với nhúm virus clade 2.3.2.1 phõn lập tại Việt Nam, Trung Quốc cỏc năm 2009 – 2012, và chủng virus A/Dk/LA/975/2010 clade 2.3.4.2 phõn lập tại Lào năm 2010. Dưới phõn nhỏnh này chứa gen PB2 của 2 chủng virus A/GCG/QH/1/2009 và A/BHG/MN/X53/2009, là
cỏc chủng virus clade 2.3.2.1 được phõn lập đầu tiờn từ chim hoang dó, tại Quảng Hải (Trung Quốc) và Mụng Cổ năm 2009. Đỏng chỳ ý là, trong dưới phõn nhỏnh này, gen PB2 của 2 biến chủng virus: DkQT801-2011 và DkQT802-2011 cựng với 3 chủng virus clade 2.3.2.1, phõn lập từ gia cầm tại Việt Nam cỏc năm 2011 và 2012, cú quan hệ gần gũi hơn với gen PB2 của chủng virus A/Hubei/1/2010, phõn lập từ người bệnh tại Trung Quốc năm 2010 (Hỡnh 3.9).
- Tương tự, gen PB2 của 2 biến chủng virus nghiờn cứu DkNA72-2007 và DkNA114-2007 clade 2.3.4.3, cựng với 2 nhúm virus clade 2.3.4.3 và 2.3.4 phõn lập trờn người, gia cầm tại Việt Nam cỏc năm 2007 – 2008, và một số chủng virus clade 2.3.2, 2.3.4, 2.3.4.1, 2.3.4.2 phõn lập tại Trung Quốc cỏc năm 2005 – 2009, gồm chủng đại diện A/Guangxi/1/2005 clade 2.3.4 thuộc genotype V (Hỡnh 3.9).
- Đặc biệt, gen PB2 của chủng virus A/VN/UT30850/2005 clade 1 phõn lập trờn người bệnh tại Việt Nam năm 2005, được xếp trong cựng dưới phõn nhỏnh với gen tương ứng, của cỏc chủng virus clade 2.3.4 thuộc genotype V phõn lập tại Trung Quốc năm 2005 – 2006 và 2 nhúm virus clade: 2.3.4, 2.3.4.3 phõn lập tại Việt Nam cỏc năm 2007 – 2008 (Hỡnh 3.9).
- Ngoài ra, gen PB2 của cỏc chủng virus clade 2.2 thuộc genotype Z và G phõn lập tại Trung Quốc và Ấn Độ cỏc năm 2006 – 2007, lại tập hợp thành một dưới phõn nhỏnh cú quan hệ xa hơn với 2 dưới phõn nhỏnh núi trờn (Hỡnh 3.9).
3.3.2. Kết quả phõn tớch xỏc định phả hệ nguồn gốc gen PB1
Kết quả xõy dựng cõy phả hệ nguồn gốc dựa trờn 56 trỡnh tự nucleotide và amino acid gen PB1, của 6 biến chủng virus cỳm A/H5N1 nghiờn cứu và 50 chủng virus tham chiếu, được trỡnh bày trong Hỡnh 3.9 và phụ lục 20 cho thấy:
Tương tự như gen PB2, kết quả xỏc định phả hệ nguồn gốc gen PB1 cũng cú sự phự hợp cả trờn trỡnh tự nucleotide và amino acid (Hỡnh 3.10 và xem phụ lục 20). Gen PB1 của 6 biến chủng virus cỳm A/H5N1 nghiờn cứu, cựng với cỏc chủng virus phõn lập cỏc năm từ 2003 – 2012, cũng tập hợp thành nhỏnh tiến húa cú quan hệ gần gũi, với nhỏnh tiến húa gồm gen tương ứng của nhúm virus clade 0 thuộc genotype GD. Nhỏnh tiến húa chứa tập hợp gen PB1 của cỏc chủng virus cỳm A/H5N1 phõn lập cỏc năm từ 2003 – 2012, cũng chia tỏch thành 2 phõn nhỏnh tiến húa khỏc nhau, gồm: phõn nhỏnh 1 và 2 gen PB1 (Hỡnh 3.10).
Hỡnh 3.10. Cõy phả hệ nguồn gốc 56 chủng virus cỳm A/H5N1 dựa trờn trỡnh tự
nucleotide gen PB1 polymerase
Ghi chỳ: Cõy phả hệ được xõy dựng bằng chương trỡnh MEGA4.1 sử dụng phương phỏp liờn kết cận kề
(Neighbour – Joining, NJ) với hệ số bootstrap = 1000 replicates. Sỏu chủng virus cỳm A/H5N1 nghiờn cứu được in chữ đậm và kớ hiệu (◄); Kớ hiệu loài vật chủ: Dk(Duck): Vịt, BHG(Bar headed - goose): Ngỗng trời, MDk(Muscovy duck): Ngan; Ck(Chicken): Gà; Goose: Ngỗng; GCG(Greate crested grebe): Sếu đầu đỏ; Chủng virus phõn lập từ người bệnh kớ hiệu theo địa danh phõn lập, VN(VietNam): Việt Nam; CN(China): Trung Quốc; Anhui: An Huy; GuiZhou: Quý Chõu; Hubei: Hồ Bắc; Hunan: Hồ Nam; Gd(Guangdong): Quảng Đụng; QH(Qinghai): Quảng Hải; Gx(Guangxi): Quảng Tõy; Fujian: Phỳc Kiến; IN: Indonesia; ID(India): Ấn Độ; KH: Campuchia; MN(Mongola): Mụng Cổ; TH(Thailand): Thỏi Lan. Kớ hiệu số và chữ cỏi trong ngoặc đơn sau danh phỏp chủng: (clade H5-genotype) của chủng virus. Cỏc chữ cỏi Z, G, V và GD: tờn genotype (kiểu gen) virus cỳm A/H5N1; Tờn chủng virus đại diện nguồn gốc genotype được đúng khung.
+ Phõn nhỏnh 1 gen PB1 cũng gồm cỏc chủng trong nhúm virus clade 1 thuộc genotype Z và nhúm virus clade 1.1, cựng với một số chủng virus clade 2.2, 2.3.2, 2.3.4, 2.1.3.2 thuộc 2 genotype Z và G, phõn lập tại Việt Nam, Thỏi Lan, Campuchia, Trung Quốc, Indonesia và Ấn Độ cỏc năm 2003 - 2011. Phõn nhỏnh 1 gen PB1 cũng chia tỏch thành cỏc dưới phõn nhỏnh nhỏ hơn (Hỡnh 3.10). Trong đú:
- Gen PB1 của 2 biến chủng virus CkDT382-2008 và DkTG926-2009 clade 1.1 nghiờn cứu, cũng tập hợp thành một dưới phõn nhỏnh cựng với nhúm virus clade 1.1 phõn lập tại Việt Nam và Campuchia cỏc năm 2007 – 2011, gồm chủng virus đại diện A/KH/R405050/2007 clade 1.1 thuộc genotype Z (Hỡnh 3.10).
- Nhúm virus clade 1 thuộc genotype Z phõn lập tại Việt Nam, Thỏi Lan cỏc năm 2003 – 2005, chứa gen PB1 cũng tập hợp thành một phõn nhỏnh khỏc cú quan hệ gần gũi với chủng virus A/HK/212/2003 clade 1 thuộc genotype Z+ (Hỡnh 3.10). - Bờn cạnh đú, gen PB1 của cỏc chủng virus clade 2.2, 2.3.2, 2.3.4, 2.1.3.2 thuộc 2 genotype Z và G, phõn lập tại Trung Quốc, Việt Nam, Indonesia và Ấn Độ cỏc năm 2004 - 2006, cũng tập hợp thành cỏc dưới phõn nhỏnh cú quan hệ xa hơn, với 02 dưới phõn nhỏnh của nhúm virus clade 1 và 1.1 kể trờn (Hỡnh 3.10).
- Đặc biệt, cỏc chủng virus clade 2.2 thuộc genotype Z và G phõn lập tại Trung Quốc và Ấn Độ cỏc năm 2006 – 2007, cú gen PB2 tập hợp trong phõn nhỏnh 2 gen PB2, nhưng lại cú gen PB1 tập hợp trong phõn nhỏnh 1 gen PB1 (Hỡnh 3.10).
+ Phõn nhỏnh 2 gen PB1 cũng gồm tập hợp cỏc chủng trong 2 nhúm virus clade 2.3.4.3 và 2.3.2.1, cựng với một số chủng virus clade 2.3.2, 2.3.4, 2.3.4.1, 2.3.4.2 thuộc genotype V, phõn lập tại Việt Nam, Lào, Trung Quốc, Nhật Bản và Mụng Cổ cỏc năm từ 2005 – 2012. Phõn nhỏnh này cũng cú sự phõn chia thành cỏc dưới phõn nhỏnh khỏc nhau (Hỡnh 3.10). Trong đú:
- Gen PB1 của 2 biến chủng virus DkQT801-2011 và DkQT802-2011 clade 2.3.2.1 nghiờn cứu cũng hợp thành một dưới phõn nhỏnh cựng với nhúm virus clade 2.3.2.1 phõn lập tại Việt Nam và Trung Quốc cỏc năm từ 2009 – 2011, gồm 2 chủng virus đại diện A/GCG/QH/1/2009 và A/BHG/MN/X53/2009. Đặc biệt, gen PB1 của 2 biến chủng virus DkQT801-2011 và DkQT802-2011 cựng với 3 chủng virus phõn lập từ gia cầm tại Việt Nam cỏc năm 2011 – 2012, cũng cú quan hệ gần gũi hơn với gen PB1 của chủng virus A/Hubei/1/2010, so với gen tương ứng của cỏc chủng virus phõn lập từ chim hoang dó trong nhúm virus clade 2.3.2.1.
- Gen PB1 của 2 biến chủng virus nghiờn cứu: DkNA72-2007 và Dk NA114- 2007 clade 2.3.4.3, cựng với 2 nhúm virus clade 2.3.4.3, 2.3.4 phõn lập tại Việt Nam cỏc năm 2007 – 2008 và một số chủng virus clade 2.3.2, 2.3.4, 2.3.4.1, 2.3.4.2 thuộc genotype V phõn lập tại Trung Quốc cỏc năm 2005 – 2009, bao gồm chủng virus đại diện A/Guangxi/1/2005. Gen PB1 của 4 chủng virus: A/Fujian/1/2005, A/Anhui/1/2005, A/CN/Gd/01/2006 và A/Dk/Hunan/856/2006 phõn lập tại Trung Quốc cỏc năm 2005 – 2006, cựng với chủng A/Dk/LA/975/2010 phõn lập tại Lào năm 2010, cũng được xếp trong dưới phõn nhỏnh tiến húa này (Hỡnh 3.10).
- Bờn cạnh đú, gen PB1 của chủng virus A/VN/UT30850/2005 clade 1, vẫn được xếp trong cựng dưới phõn nhỏnh tiến húa với gen PB1, của cỏc chủng virus clade 2.3.4 phõn lập tại Trung Quốc cỏc năm 2005 – 2006 và nhúm cỏc chủng virus clade 2.3.4, 2.3.4.3 phõn lập tại Việt Nam cỏc năm 2007 – 2008 (Hỡnh 3.10).