CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.4. Phương pháp đánh giá thành phần và hoạt tính sinh học của cao trích vỏ chuố
2.2.4.1. Phương pháp xác định hàm lượng tổng hợp chất phenolic trong cao trích vỏ chuối
Nguyên tắc: Thuốc thử Folin-Ciocalteu chứa chất oxy hóa là acid phospho-vonframic
sẽ oxy hóa các nhóm hydroxy polyphenol tạo ra các acid heteroply màu xanh da trời có độ hấp thụ cực đại tại bước sóng 765 nm. Dựa vào độ hấp thụ, hàm lượng tổng hợp chất phenolic trong mẫu cao trích được xác định dựa vào đường chuẩn acid gallic (TCVN 9745-1, 2013).
Phương pháp xác định hàm lượng tổng hợp chất phenolic được tiến hành dựa trên tiêu chuẩn quốc gia TCVN 97451 với một số điều chỉnh cho phù hợp với điều kiện thí nghiệm. Cân chính xác 0,2000g mẫu cao trích cho vào ống chiết thuỷ tinh có nắp. Thêm 9,80 mL hỗn hợp dịch chiết nóng ethanol:nước (9:1) ở 70oC vào ống và trộn đều bằng máy trộn vortex trong 30 giây. Sau đó chuyển ống chiết chứa mẫu qua máy đánh siêu âm trong vòng 2 phút. Tiếp tục đun nóng ống chiết ở 70oC trong 10 phút tại bể điều nhiệt và trộn mẫu trên máy vortex sau mỗi 5 phút. Sau đó, tiến hành ly tâm với vận tốc 3500 rpm/phút trong 10 phút. Lấy 0,20 mL dịch nổi bên trên ống chiết cho vào ống nghiệm, thêm 9,80 mL nước cất (pha lỗng 50 lần). Sau đó, tiến hành lấy 1,30 mL dung dịch mẫu đã được pha loãng vào ống nghiệm 10 mL. Thêm 1,00 mL thuốc thử Folin-Ciocalteu 20% vào ống, lắc đều và để yên 5 phút. Tiếp tục thêm vào 700 µL Na2CO3 10%, để yên 30 phút trong bóng tối. Tiến hành đo độ hấp thụ trên máy đo UV-Vis ở bước sóng 760 nm. Mẫu đối chứng được chuẩn bị theo cách tương tự nhưng thay dung dịch cao trích ban đầu bằng hỗn hợp ethanol:nước (9:1). Kết quả hàm lượng tổng hợp chất phenolic được tính và thể hiện dưới dạng mg GAE/g chất khơ.
Cao trích vỏ chuối Định lượng Phối trộn 1 Gia nhiệt Ly tâm Pha lỗng Phối trộn 2 Ethanol:nước (9:1) Folin 20% Na2CO3 Đặt trong bóng tối Kết quả Đo độ hấp thụ ở 760 nm
Hình 2.3. Sơ đồ quy trình xác định hàm lượng tổng hợp chất phenolic
2.2.4.2. Phương pháp đánh giá khả năng ức chế gốc tự do DPPH trong cao trích vỏ chuối chuối
Nguyên tắc: Dung dịch DPPH có màu đỏ tía hấp thụ cực đại tại bước sóng 517 nm.
Các chất chống oxy hóa sẽ trung hịa gốc tự do DPPH bằng cách cho hydrogen, làm giảm độ hấp thụ tại bước sóng cực đại và màu của dung dịch phản ứng nhạt dần. Dung dịch này sẽ chuyển từ màu đỏ tía sang màu vàng nhạt. Giá trị mật độ quang càng thấp chứng tỏ khả năng bắt gốc tự do DPPH càng cao (TCVN 11939, 2017).
Phương pháp đánh giá khả năng ức chế gốc tự do DPPH của cao trích được xác định theo phương pháp của Yin Yin Tun và cộng sự (2019) với một số thay đổi để phù hợp với điều kiện phịng thí nghiệm. Cân 0,0100g cao trích vỏ chuối cho vào ống nghiệm thủy tinh có nắp. Thêm 9,99 mL nước cất vào ống và trộn đều bằng máy trộn vortex trong 30 giây. Sau đó chuyển ống nghiệm chứa mẫu qua máy đánh siêu âm trong vịng 3 phút. Pha lỗng hỗn hợp dung dịch cao trích theo các nồng độ khác nhau (10, 25, 50, 100 µg/mL). Lấy 1,5 mL mẫu dung dịch cao trích đã được pha lỗng trộn với 1,5 ml DPPH 0,15 mM (DPPH được pha trong ethanol 96%). Lắc mạnh hỗn hợp và đặt trong bóng tối 30 phút ở nhiệt độ phịng. Sau đó dung dịch được đo độ hấp thụ ở bước sóng 517 nm. Mẫu đối chứng ở mỗi nồng độ được chuẩn bị theo cách tương tự nhưng thay dung dịch cao trích bằng ethanol 96%. Acid gallic được sử dụng làm chất chuẩn (Yin Yin Tun và cộng sự, 2019).
Cao trích vỏ chuối Phối trộn Đặt trong bóng tối DPPH Kết quả Pha lỗng Đo độ hấp thụ ở 517 nm
Hình 2.4. Sơ đồ quy trình đánh giá khả năng thu nhận gốc tự do DPPH
Phần trăm khả năng thu nhận gốc tự do DPPH được tính theo cơng thức của Mannan và cộng sự (2017) như sau: (Md. Abdul Mannan và cộng sự, 2017)
I (%)=Ac− As
IC50 là nồng độ của mẫu cao ức chế 50% gốc tự do DPPH ở điều kiện xác định (Mạc Xuân Hòa và cộng sự, 2019). Với những mẫu cao trích có hoạt tính ức chế DPPH biến thiên tuyến tính với nồng độ cao trích (r2 ≥ 0,95), IC50 được nội suy từ đường thẳng có dạng phương trình tổng quát 𝑦 = 𝑎𝑥 + 𝑏 đi qua tất cả các điểm (với y là % ức chế DPPH và x là nồng độ cao trích). Với những mẫu cao trích có hoạt tính ức chế DPPH khơng biến thiên tuyến tính với nồng độ cao trích (r2 < 0,95), IC50 được nội suy tuyến tính giữa 2 nồng độ mà tại đó, nồng độ mẫu cao trích thể hiện khả năng ức chế trên và dưới 50% gốc tự do DPPH.
2.2.4.3. Phương pháp đánh giá năng lực khử trong cao trích vỏ chuối
Nguyên tắc: Quá trình khử Fe3+ thường được dùng để chỉ thị khả năng nhường electron của các chất chống oxy hóa như polyphenol. Trong thí nghiệm này, sự có mặt của các chất khử (chất chống oxy hoá) trong các mẫu sẽ khử Fe3+ thành Fe2+ bằng việc cho đi một điện tử. Phức hợp của Fe2+ hình thành được đo ở bước sóng 700 nm. Sự tăng độ hấp thụ tại bước sóng này cho thấy sự gia tăng về đặc tính khử của mẫu (Abbas Ali Dehpour và cộng sự, 2009).
Năng lực khử Fe3+ về Fe2+ của cao trích vỏ chuối được xác định theo phương pháp của Nayan và cộng sự (2013) với một số điều chỉnh cho phù hợp với điều kiện thí nghiệm. Cân 0,0100g cao trích vỏ chuối cho vào ống chiết thủy tinh có nắp. Thêm 9,99 mL nước cất và trộn đều bằng máy trộn vortex trong thời gian 30 giây. Pha lỗng dung dịch cao trích bằng nước cất theo các nồng độ khác nhau (0,1; 0,5; 1,0 mg/mL). Lấy 1,0 mL dung dịch cao trích đã được pha loãng ở trên phối trộn với 2,5 mL đệm phosphate 2,0 M (KH2PO4 – K2PSO4) có pH =6,6 và 2,5 mL potassium ferricyanide 1%. Hỗn hợp được đặt trong bể điều nhiệt ở 50oC trong 20 phút. Sau đó bổ sung thêm 2,5 mL TCA 10% và tiến hành ly tâm ở chế độ 2000 rpm/phút trong vòng 10 phút. Thu 2 mL lớp nổi lên phía trên của dung dịch mang phối trộn với 2 mL nước cất và 0,4 mL ferric chloride 0,1%. Tiến hành đo độ hấp thụ ở bước sóng 700 nm. Mẫu đối chứng ở mỗi nồng độ được làm tương tự nhưng thay dung dịch cao trích pha lỗng bằng nước cất với cùng thể tích (Nayan R. Bhalodia và cộng sự, 2013; P. Negi và cộng sự, 2005).
Cao trích vỏ chuối Phối trộn 1 Ủ Phối trộn 3 Phối trộn 2 Ly tâm Đệm phosphate K3[Fe(Cn)6] 1% TCA 10% Nước cất FeCl3 Kết quả Đo độ hấp thụ ở 700 nm
Hình 2.5. Sơ đồ quy trình đánh giá năng lực khử
2.2.4.4. Phương pháp đánh giá khả năng ức chế enzyme PPO trong cao trích vỏ chuối Ngun tắc: Trong mơi trường đệm pH = 6,8, enzyme PPO sẽ chuyển hóa L-DOPA
thành DOPA-chrome. Phản ứng này làm cho dung dịch chuyển từ không màu sang màu cam hấp thụ cực đại tại bước sóng 475 nm. Các mẫu khảo sát hoạt tính ức chế enzyme PPO sẽ làm giảm hoạt tính xúc tác của enzyme dẫn đến cường độ màu sẽ bị giảm đi (Worrawat Promden và cộng sự, 2018).
Khả năng ức chế enzyme PPO được xác định theo phương pháp W. Promden và cộng sự (2018) với một số điều chỉnh cho phù hợp với bài thí nghiệm. Cân 0,0100g cao trích vỏ chuối cho vào ống chiết thủy tinh có nắp. Thêm 9,99 mL nước cất và trộn đều bằng máy trộn vortex trong 30 giây. Phối trộn các dung dịch theo thứ tự trong bảng 2.2. Tiến hành đo độ
Bảng 2.2. Bảng thiết kế thí nghệm đánh giá khả năng ức chế enzyme PPO
STT
Nồng độ cao trích
100 µg/mL 50 µg/mL 25 µg/mL
Blank Sample Blank Sample Blank Sample
1 DD cao trích* (µL) 300 300 150 150 75 75 2 Đệm (µL) 1700 1440 1850 1590 1925 1665 3 Enzyme (µL) 0 260 0 260 0 260 4 Ủ 30 phút ở nhiệt độ lạnh (1oC – 3oC) 5 L-DOPA (µL) 1000 1000 1000 1000 1000 1000 6 Lắc đều 7 phút STT Nồng độ cao trích Đối chứng 10 µg/mL 5 µg/mL
Blank Sample Blank Sample Blank Sample
1 DD cao trích** (µL) 300 300 150 150 0 0 2 Đệm (µL) 1700 1440 1850 1590 2000 1740 3 Enzyme (µL) 0 260 0 260 0 260 4 Ủ 30 phút ở nhiệt độ lạnh (1oC – 3oC) 5 L-DOPA (µL) 1000 1000 1000 1000 1000 1000 6 Lắc đều 7 phút
Hoạt tính ức chế enzyme PPO được tính theo cơng thức của Thanasak Sae-leaw (2019) như sau:
Phần trăm ức chế enzyme PPO (%)=Ac − As Ac ×100 Trong đó: Ac là giá trị độ hấp thụ đo được trong mẫu đối chứng.
Cao trích vỏ chuối Ủ Dung dịch PPO L-DOPA Lắc Kết quả Pha lỗng Phối trộn Đo độ hấp thụ ở 475 nm
Hình 2.6. Sơ đồ quy trình đánh giá khả năng ức chế enzyme PPO
2.2.4.5. Phương pháp xác định thành phần hóa học trong cao trích vỏ chuối bằng kỹ thuật HPLC thuật HPLC
Trong nghiên cứu này thành phần hóa học của cao trích vỏ chuối được xác định bằng kỹ thuật HPLC-ESI-MS
Quy trình sắc ký lỏng (Quy trình LC)
Pha tĩnh: ct ACE3- C18 (4,6 ì150mm; 3,5 àm), c n nhit ở 40°C. Pha động: chương trình pha động được thực hiện theo bảng 2.2 với tốc độ dịng 0,5 mL/phút. Trong đó, pha A là dung dịch nước cất chứa 0,1% acid formic và pha B là ACN chứa 0,1% acid formic. Thể tích mẫu tiêm là 20 µL.
Bảng 2.3. Chương trình pha động trên cột C18
Thời gian (phút) % Pha A* % Pha B*
0 95 5
2 95 5
25 0 100
30 0 100
(∗): tính theo % về thể tích
Đầu dị khối phổ (MS) với giao diện phun ion (ESI-MS)
Trước khi vào pha động của máy khối phổ, pha động giải ly ra từ cột sắc ký được cho hòa tan vào một hệ mạng chất lỏng (liquid matrix): có thể là nước hoặc nước-hữu cơ, bấy giờ xem như là có dung dịch chất điện ly. Pha động này được cho đi vào ống mao quản làm bằng thép khơng gỉ, đường kính 0,1 – 0,5 mm và được phun sương ra khỏi ống vi quản với vận tốc phun sương chậm 10 – 20 µL/phút. Độ đúng ion m/z được hiệu chỉnh trên dung dịch hiệu chỉnh ESI – L tuning mix bằng bộ bơm mẫu trực tiếp Syringe tại tốc độ 200 μL/giờ.
2.2.5. Phương pháp chuẩn bị tôm thẻ chân trắng 2.2.5.1. Phương pháp xử lý tôm 2.2.5.1. Phương pháp xử lý tôm
Sử dụng tôm thẻ chân trắng với số lượng từ 30 – 35 con/kg được cung cấp từ chợ địa phương Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam với cùng một tiểu thương để thực hiện thí nghiệm. Tơm cịn sống và tươi, được vận chuyển đến Khoa Cơng nghệ Thực phẩm, Đại học Sư phạm Kỹ thuật Thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam trong vịng 15 phút. Khi đến nơi, đưa tôm vào tủ lạnh ở nhiệt độ 1-3oC cho đến khi sử dụng (giữ tối đa 1 giờ).
2.2.5.2. Phương pháp xử lý tơm bằng cao trích vỏ chuối
Dung dịch BPE được chuẩn bị bằng cách hịa cao trích vỏ chuối vào nước cất lần lượt theo các nồng độ khác nhau (0,1%; 0,5% và 1% w/v). Sau đó, tơm ngun con (bao gồm cả phần đầu) được ngâm trong dung dịch BPE đã được chuẩn bị theo tỷ lệ giữa tôm và dung dịch BPE là 1:2 (g/mL) ở nhiệt độ phịng trong 30 phút và được kí hiệu lần lượt là “BPE- 0.1”, “BPE-0.5” và “BPE-1” tương ứng với mẫu được xử lí với cao trích vỏ chuối ở nồng độ 0,1%, 0,5% và 1%. Tôm được ngâm trong nước cất cùng điều kiện được lấy làm mẫu đối chứng. Tôm sau khi được xử lý sẽ được mang đi làm ráo trong 10 phút. Mỗi mẫu (khoảng 20 con tôm) được đặt trên khay, bọc lại và bảo quản trong nước đá vảy. Các mẫu được lấy
ngẫu nhiên để phân tích sau mỗi 2 ngày và phân tích đến ngày thứ 8 (Thanasak Sae-leaw và Soottawat Benjakul, 2019b).
2.2.6. Phương pháp đánh giá khả năng bảo quản của BPE lên tôm thẻ chân trắng 2.2.6.1. Phương pháp xác định pH thịt tôm 2.2.6.1. Phương pháp xác định pH thịt tôm
pH thịt tôm được tiến hành theo phương pháp của Maria Elvira Lo´pez-Caballero và cộng sự (2007). Với từng mẫu tôm đã được xử lý, lấy 10g phần thịt tôm trộn với 20mL nước cất và mang đi đồng hóa. Sau 5 phút ở nhiệt độ mơi trường, hỗn hợp được đo bằng máy pH hãng Mettler Toledo AG 8603. (Maria Elvira Lo´pez-Caballero và cộng sự, 2 007).
2.2.6.2. Phương pháp đánh giá melanosis trên tôm
Thực hiện đánh giá melanosis trên mẫu tôm đối chứng và mẫu tôm được ngâm với dung dịch cao trích từ vỏ chuối vào ngày thứ 0, 2, 4, 6 và 8. Tôm được đặt trên nền xanh lục với số lượng 5 con và đưa vào buồng chụp với ánh sáng cố định. Sử dụng máy ảnh Canon EOS 60D với thông số ISO 800, tốc độ màn chập 1/60s, khẩu độ f5,6 để thu hình ảnh. Sự thay đổi màu sắc trên các mẫu tôm được đánh giá thơng qua độ xám trung bình từ phần mềm ImageJ 1.52a (Image Processing and Analysis in Java). Độ xám trung bình càng nhỏ, sắc tố đen càng cao.
2.2.6.3. Phương pháp xác định chỉ số oxy hóa TBARS thịt tơm
Nguyên tắc: Q trình peroxy hóa lipid tạo ra sản phẩm cuối cùng bao gồm lipid
hydroperoxide, aldehyde, và malondialdehyde (MDA). Các hợp chất này tác dụng với TBA tạo nên sắc tố làm thay đổi màu sắc dung dịch. Trong đó, MDA được đánh giá là một trong những chất phân tích được sử dụng với mục đích ước tính kết quả của q trình peroxy hóa lipid. MDA khi kết hợp với TBA tạo thành MDA-TBA2 mang sắc tố hồng, hấp thụ cực đại tại bước sóng 532 nm. Dựa vào độ hấp thụ, các mẫu được tính dựa trên đường chuẩn MDA để xác định chỉ số oxy hóa có trong mẫu tơm (Hamdy F. Moselhy và cộng sự, 2013).
Chỉ số oxy hóa TBARS trong các mẫu được xác định theo mô tả của Benjakul và Bauer (2001) với một số sửa đổi để phù hợp với điều kiện thí nghiệm. Lấy 1g thịt tôm xay trộn với 9 mL dung dịch HCl 0,25 N chứa 0,375% TBA và 15% TCA. Hỗn hợp được đun nóng trong nước sơi trong 10 phút, sau đó làm mát dưới vòi nước chảy. Hỗn hợp được ly tâm với tốc độ 4000 rpm/phút trong thời gian 20 phút bằng máy ly tâm. Thu phần dung dịch bên trên và đo
chuẩn bị theo cách tương tự nhưng thay thế 1g thịt tôm bằng 1mL hỗn hợp HCl. Chỉ số TBARS được tính tốn dựa theo đường chuẩn của MDA (2 – 8 ppm) và được biểu thị bằng mg MDA/kg thịt tôm (T. Sae-Leaw và S. Benjakul, 2019).
Thịt tôm
Hỗn hợp HCl chứa TBA, TCA
Định lượng Phối trộn Đun sôi Làm mát Ly tâm Thu dung dịch bề mặt Kết quả Đo độ hấp thụ ở 532 nm
Hình 2.7. Sơ đồ quy trình xác định chỉ số oxy hóa TBARS
2.2.6.4. Phương pháp đánh giá chỉ tiêu vi sinh vật trên tôm
Các mẫu tơm sau khi xử lí với BPE và mẫu tơm đối chứng được mang đi đánh giá chất lượng vi sinh thông qua các chỉ tiêu gồm tổng vi sinh vật hiếu khí, Pseudomonas aeruginosa, và vi sinh vật khử sulfit tại phịng thí nghiệm Phân tích thực phẩm và thức ăn chăn nuôi Upscience Việt Nam, Khu phố 1B, phường An Phú, Thị xã Thuận An, tỉnh Bình Dương.
2.2.6.5. Phương pháp đánh giá chỉ tiêu TVB-N trên tôm
Các mẫu tơm sau khi xử lí với BPE và mẫu tơm đối chứng được mang đi đánh giá chỉ tiêu tổng hàm lượng nitơ bazơ bay hơi (TVB-N) trong thịt tơm tại phịng thí nghiệm Phân tích thực phẩm và thức ăn chăn ni Upscience Việt Nam, Khu phố 1B, phường An Phú, Thị xã Thuận An, tỉnh Bình Dương.
2.2.7. Phương pháp xử lý số liệu thống kê
Mỗi thí nghiệm phân tích đều được thực hiện lặp lại 3 lần. Số liệu được xử lý bằng phương pháp phân tích phương sai một yếu tố (one-way ANOVA) bằng phần mềm SPSS 22 (SPSS Institute Inc., Cary, NC, USA) và được phân tích hậu định (post–hoc analysis) bằng phương pháp Ducan (p-value ≤ 0,05) để phân tích sự khác biệt có ý nghĩa giữa các giá trị trung bình. Kết quả xử lý được trình bày dưới dạng: giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (n=3).
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Ảnh hưởng của các giai đoạn chín của chuối đến khả năng chống oxy hố trong