1.5.2. Ảnh hưởng của quá trình melanosis và các biện pháp kiểm sốt q trình melanosis trong tơm melanosis trong tơm
Sự hình thành hắc sắc tố melanin do phản ứng melanosis rất phổ biến ở động vật giáp xác. Ở tơm, q trình melanosis xảy ra rất nhanh sau khi đánh bắt và bảo quản trong điều kin thng (Alex Augusto Gonỗalves và Adriene Rosceli Menezes de Oliveira, 2016). Những đốm đen bắt đầu hình thành ở lớp vỏ giáp phần đầu – ngực tơm. Sau đó xuất hiện tập trung ở lớp biểu bì khớp bụng và cuối cùng lan ra tới đuôi (Pilar Montero và cộng sự, 2001). Thơng thường, tốc độ hình thành hắc sắc tố melanin ở tôm nhanh hơn nhiều so với tốc độ gây hư hỏng của vi sinh vật. Do đó, q trình melanosis khơng phản ánh sự suy giảm giá trị dinh dưỡng và tính an tồn của sản phẩm (Sae-leaw Thanasak và Benjakul Soottawat, 2019). Nhưng việc xuất hiện các đốm đen trên tôm cho thấy q trình bảo quản tơm sau thu hoạch khơng tốt, làm giảm giá trị cảm quan và giá trị kinh tế của sản phẩm (Pilar Montero và cộng sự, 2001). Nhằm khắc phục những nhược điểm mà quá trình melanosis gây ra, các biện pháp bảo quản động vật giáp xác nói chung và bảo quản tơm nói riêng được tập trung nghiên cứu.
Hình 1.9. Các đốm đen xuất hiện ở lớp biểu bì khớp bụng và đi tơm sau khi thu hoạch Cách đơn giản nhất để kiểm sốt q trình melanosis là bảo quản lạnh hoặc lạnh đông tôm ngay sau khi đánh bắt. Tuy nhiên việc bảo quản lạnh chỉ làm giảm tốc độ hình thành hắc sắc tố melanin, khơng ức chế hồn tồn q trình melanosis và tơm có thể bị đen sau 2 đến 4 ngày bảo quản (Alford John A và Fieger E. A, 1952). Ngay cả bảo quản tôm bằng quá trình lạnh đơng, các enzyme PPO cũng chỉ bất hoạt tạm thời. Khi rã đông, các enzyme PPO trong các tuyến tiêu hóa sẽ dễ dàng được giải phóng, thúc đẩy q trình hình thành melanin nhanh hơn (Nilesh Prakash Nirmal và Soottawat Benjakul, 2010).
Để khắc phục nhược điểm của q trình bảo quản lạnh và lạnh đơng, nhiều phương pháp và kỹ thuật giúp kiểm sốt q trình melanosis trên tơm sau khi đánh bắt đã được nghiên cứu và áp dụng (Santiago P. Aubourg và cộng sự, 2007). Một số phương pháp phổ biến như tiền xử lý nhiệt, xử lý bằng áp suất cao, sử dụng bao gói khí quyển điều chỉnh MAP (Modified Atmosphere Packaging) hoặc sử dụng các chất ức chế enzyme PPO (Alex Augusto Gonỗalves v Adriene Rosceli Menezes de Oliveira, 2016). Trong đó, việc sử dụng chất ức chế enzyme PPO được đánh giá cao vì tính hiệu quả và phương pháp thực hiện đơn giản. Dựa vào cơ chế tác động, các chất ức chế q trình melanosis trên tơm thường được phân thành sáu loại và được thể hiện trong bảng 1.8.
Bảng 1.8. Các chất ức chế quá trình melanosis phổ biến (Jeongmok Kim và cộng sự, 2000). (Jeongmok Kim và cộng sự, 2000).
Tác nhân khử Tác nhân chứa sulfit
Acid ascorbic và các chất tương tự Cysteine glutathione
Tác nhân ức chế enzyme Các acid carboxylic chứa vòng thơm Aliphatic alcohol
Tác nhân acid hóa Acid citric Acid phosphoric
Tác nhân tạo phức Cyclodextrins
Tác nhân chelating Muối phosphate EDTA
Maltol Acid kojic
Kỹ thuật xử lý bằng enzyme Oxygenases
o-Methyl transferase Proteases
Trong các chất ức chế quá trình melanosis, sulfit và các dẫn xuất của sulfit, điển hình là SMS thường được sử dụng do mang lại hiệu quả cao (Tổng Cục Thủy Sản, 2017). Cơ chế kìm hãm phản ứng melanosis của SMS bao gồm: (i) SMS sẽ phản ứng với các hợp chất
(Obdulio J. Ferrer và cộng sự, 1989). Theo FDA (2019), sulfit an toàn đối với hầu hết mọi người nếu sử dụng đúng liều lượng. Nhưng nhiều báo cáo đã chỉ ra người mắc bệnh hen sẽ dễ xảy ra dị ứng với sulfit (Nilesh Prakash Nirmal và Soottawat Benjakul, 2011). Do đó một số quốc gia trên thế giới như Mỹ và EU đã yêu cầu dán nhãn dị ứng đối với các sản phẩm có chứa sulfit. Những nhãn dị ứng này có thể khiến người mua lo ngại về chất lượng sản phẩm, kể cả những người không bị dị ứng với sulfit (Tổng Cục Thủy Sản, 2017). Vì vấn đề sức khỏe cho người tiêu dùng và hạn chế những hiểu lầm do nhãn dị ứng gây ra, các chất bảo quản có nguồn gốc từ tự nhiên đang được nghiên cứu nhằm thay thế cho sulfit và các dẫn xuất của sulfit. Một trong số đó là những nghiên cứu ứng dụng các hợp chất phenolic có nguồn gốc từ thực vật (Thanasak Sae-leaw và Soottawat Benjakul, 2019a).
Các hợp chất phenolic được trích ly từ thực vật có khả năng ức chế enzyme PPO và ngăn chặn phản ứng melanosis ở động vật giáp xác thông qua các cơ chế khác nhau như: (i) cạnh tranh với cơ chất của PPO do cấu trúc tương tự (T Croguennec, 2016); (ii) tương tác với enzyme hoặc protein thông qua liên kết hydro hoặc liên kết kỵ nước (Tanja D. Cirkovic Velickovic và Dragana J. Stanic-Vucinic, 2018); (iii) Hơn nữa, các nhóm hydroxyl của hợp chất phenolic có khả năng nhường điện tử cho quinone, chấm dứt chuỗi phản ứng oxy hóa; (iv) Ngồi ra, các dẫn xuất phenolic cịn có khả năng tạo phức với các ion kim loại, đặc biệt là Cu2+ ở trung tâm hoạt động của PPO thơng qua các liên kết hydro. Từ đó ức chế hoạt động của enzyme PPO (Isao Kubo và Ikuyo Kinst-Hori, 1998).
1.6. Một số nghiên cứu đã được tiến hành để đánh giá khả năng ứng dụng dịch trích ly từ thực vật trong q trình bảo quản tơm từ thực vật trong q trình bảo quản tơm
Hiện nay có nhiều cơng trình nghiên cứu ứng dụng dịch trích ly từ thực vật để bảo quản tôm thẻ chân trắng. Các nghiên cứu này sử dụng dịch trích ly từ các nguồn thực vật khác nhau và mang lại nhiều kết quả khả quan. Bảng 1.9 thống kê một số nghiên cứu nổi bật về khả năng sử dụng dịch trích ly từ thực vật trong việc bảo quản tôm.
Trong số các nghiên cứu đã thực hiện ở trên, dịch trích ly từ vỏ chuối cho thấy tiềm năng ứng dụng trong bảo quản tôm với nhiều ưu điểm nổi bật. Ở Việt Nam, chuối là cây được trồng phổ biến và sản lượng cao. Hơn nữa, vỏ chuối chứa nhiều các hợp chất phenolic có hoạt tính sinh học cao và có khả năng chống vi sinh vật (Rafaela González-Montelongo và cộng sự, 2010). Trong nghiên cứu gần đây, C. Noysang và cộng sự (2019) đã chỉ ra dịch trích ly từ vỏ chuối có khả năng ức chế tốt enzyme PPO. Từ đó mở ra cơ hội cho việc ứng dụng dịch trích ly từ vỏ chuối trong việc kiểm sốt q trình melanosis ở tơm sau thu hoạch.
Tuy nhiên, các nghiên cứu trước đó về vỏ chuối chỉ tập trung nghiên cứu định lượng hợp chất phenolic, so sánh hàm lượng các chất có hoạt tính sinh học có trong dịch trích giữa các giống chuối khác nhau hoặc điều kiện canh tác khác nhau mà chưa có một nghiên cứu nào mang tính chất tổng thể và đầy đủ theo các giai đoạn chín của chuối. Ngồi ra, vẫn chưa có biện pháp giải quyết phế phẩm trong quá trình sản xuất các sản phẩm thực phẩm có ngun liệu là chuối. Vì vậy, nghiên cứu này tập trung khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian chín đến sự thay đổi các tính chất chống oxy hóa và ức chế enzyme PPO trong vỏ chuối. Từ đó, nghiên cứu ứng dụng dịch trích ly này để bảo quản tơm thẻ chân trắng nhằm khảo sát đầu ra cho phế phẩm vỏ chuối.
Bảng 1.9. Một số nghiên cứu ứng dụng dịch trích ly từ thực vật để bảo quản tơm
Loại dịch trích Đối tượng Cách xử lý Nồng độ
tối ưu Tác giả
Dịch trích lá điều Tơm thẻ chân trắng Dịch trích lá điều 1% Sae-leaw và
Benjakul (2019)
Dịch trích vỏ cam Tôm thẻ chân trắng Ngâm trực tiếp 5% Vakili và
Ardakani (2018)
Dịch trích trà xanh Tôm thẻ chân trắng Ngâm trực tiếp và
kết hợp với chitosan
1% GTE Yuan và Sun
(2016)
Dịch trích vỏ lựu Tơm thẻ chân trắng Ngâm trực tiếp và
kết hợp với chitosan 1,5% dịch trích và 1% chitosan Yuan và Sun (2016)
Dịch trích vỏ lựu Tơm thẻ chân trắng Ngâm trực tiếp 1% Basiri và cộng sự
(2015)
Dịch trích quả sơ ri Tôm thẻ chân trắng Ngâm trực tiếp 2,5% Gonỗalves v
cng s (2015)
Dịch trích keo đậu Tôm thẻ chân trắng Ngâm trực tiếp 0,5% Nirmal và
Benjakul (2011) Dịch trích trà xanh
và trà dâu tằm
Tôm thẻ chân trắng Ngâm trực tiếp 0,5% Nirmal và
Benjakul (2011)
Dịch trích hạt nho Tơm hồng nước sâu Ngâm trực tiếp 1,5% Gokoglu và
CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu, hóa chất và dụng cụ thiết bị
2.1.1. Nguyên liệu
Các buồng chuối sứ sử dụng trong nghiên cứu được lấy từ chợ nông sản Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam vào tháng 3, năm 2020 với cùng một tiểu thương.
2.1.2. Hóa chất
Tên hóa chất Nguồn gốc Số CAS
Ethanol (EtOH) 96% Chemsol, Việt Nam -
Dipotassium phosphate (K2HPO4) Xilong Chemical, Trung Quốc -
Monopotassium phosphate (KH2PO4) Xilong Chemical, Trung Quốc -
Potassium ferricyanide (K3[Fe(CN)6]) Xilong Chemical, Trung Quốc -
Ferric chloride (FeCl3) Xilong Chemical, Trung Quốc -
Sodium carbonate (Na2CO3) Xilong Chemical, Trung Quốc -
Acid hydrochloric (HCl) Xilong Chemical, Trung Quốc -
Sodium metabisulfit (SMS) Xilong Chemical, Trung Quốc -
Acid kojic (C6H6O4) Sigma-Aldrich, USA 501-30-4
Folin-Ciocalteu (FC) Sigma-Aldrich, USA 149-91-7
2,2-diphenyl-1-picryl hydrazyl (DPPH) Sigma-Aldrich, USA 1898-66-4
Acid gallic (C7H6O5) Sigma-Aldrich, USA 5995-86-8
L-3,4-Dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) Sigma-Aldrich, USA 59-92-7
Acid thiobarbituric (TBA) Sigma-Aldrich, USA 504-17-6
Malondialdehyde (MDA) Eagle Biosciences, USA 100683-54-3
Acid trichloroacetic (TCA) Merck, Đức 76-03-9
2.1.3. Dụng cụ và thiết bị
Tên dụng cụ, thiết bị Nguồn gốc
Các dụng cụ thí nghiệm cơ bản Duran, Đức
Cuvet thủy tinh Trung Quốc
Giấy lọc Số 1, Advantec, Nhật Bản
pH kế Mettler Toledo AG 8603 SevenEasy, Đức
Cân phân tích 4 số LX220A, Precisa, Thuỵ Sỹ Máy quang phổ UV-Vis UH-5300, Hitachi, Nhật Bản
Tủ sấy UN55, Memmert, Đức
Bể điều nhiệt WNB14, Memmert, Đức
Bể đánh siêu âm S 100 H, Elmasonic, Đức
Thiết bị cô quay RE 301A-W, Yamato, Nhật Bản Thiết bị đồng hóa T 25 Digital Ultra-turrax, IKA, Đức
Thiết bị ly tâm Z 206A, Hermle, Đức
Hệ thống sắc ký lỏng siêu cao áp - Bộ bơm mẫu trực tiếp bằng
Syringe KdScientifit, USA
- Hệ thống khối phổ MS/MS Bruker, Germany
2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu
Buồng chuối
Lấy quả theo kế hoạch
Tách vỏ, bỏ cuống đen ở đầu quả
Xử lý tạo thành bột vỏ chuối (BPP)
Ngâm BPP trong ethanol 96%. Tỉ lệ 1 BPP : 3 ethanol (w/v). Lặp lại 3 lần, mỗi lần 24 giờ
Xử lý tạo thành cao trích vỏ chuối (BPE)
Phân tích mẫu Xác định thành phần hóa học Xác định hoạt tính TPC; HPLC – MS. Ức chế DPPH; Năng lực khử Fe3+về Fe2+ ; Ức chế enzyme PPO. Ứng dụng trên tôm
Tôm thẻ chân trắng (sống) được lấy từ chợ Thủ Đức (30-35 con/kg)
Bảo quản trong tủ lạnh với nhiệt độ từ 1-3oC cho tới khi sử dụng (thời gian bảo quản tối đa 1 giờ)
Rửa lại bằng nước lạnh và để ráo
Ngâm BPE 0,1% với tỉ lệ tôm:dung dịch là 1:2 (w/v) Ngâm BPE 0,5% với tỉ lệ tôm:dung dịch là 1:2 (w/v) Ngâm BPE 1% với tỉ lệ tôm:dung dịch là 1:2 (w/v)
Ngâm nước với tỉ
lệ tôm:nước là 1:2 (w/v) (mẫu đối chứng) Bảo quản lạnh ở 1-3o C Phân tích mẫu
Chỉ tiêu vi sinh Chỉ tiêu hóa học Đánh giá melanosis
Tổng VSV hiếu khí; P. aeruginosa; VSV kị khí khử sulfit. pH thịt tôm; TVB-N; TBARS.
Thuyết minh quy trình
Giai đoạn 1: Chuối sau khi mua về từ chợ nơng sản Thủ Đức được để chín tự nhiên. Sau đó, chuối được tách ruột và xử lý tạo thành 6 mẫu bột vỏ chuối tương ứng với 6 giai đoạn chín. Tiếp theo ngâm bột vỏ chuối trong ethanol 96% bằng phương pháp ngâm dầm rồi lọc để thu dịch. Hỗn hợp dịch được cô quay và sấy tới khối lượng khơng đổi để tạo thành cao trích vỏ chuối. Tương ứng với 6 giai đoạn chín của chuối là 6 mẫu cao trích.
Giai đoạn 2: Các mẫu cao trích vỏ chuối sẽ được đánh giá các chỉ tiêu bao gồm hàm lượng TPC, khả năng ức chế DPPH, năng lực khử Fe3+ về Fe2+ và khả năng ức chế enzyme PPO để lựa chọn mẫu cao trích tối ưu, phù hợp cho ứng dụng bảo quản tôm thẻ chân trắng. Mẫu cao trích tối ưu sẽ tiếp tục được phân tích HPLC để định tính sơ bộ thành phần hóa học. Giai đoạn 3: Tơm được xử lý với mẫu cao trích vỏ chuối được lựa chọn ở giai đoạn 2 tại các nồng độ khác nhau. Sau đó, các mẫu tơm được đánh giá các chỉ tiêu như pH thịt tơm, q trình melanosis, chỉ số oxy hóa TBARS để lựa chọn nồng độ cao trích tối ưu cho việc bảo quản tôm. Cuối cùng, mẫu cao trích có nồng độ tối ưu được phân tích thêm chỉ tiêu vi sinh vật và TVB-N trong điều kiện bảo quản lạnh.
2.2.2. Phương pháp xử lý tạo bột vỏ chuối
Chuối được để chín tự nhiên và phân thành sáu giai đoạn chín. Mỗi giai đoạn chín, chuối sẽ được lấy với số lượng từ 20 đến 25 quả/buồng và được kí hiệu theo thứ tự từ M1 tới M6, tương ứng với chuối ở giai đoạn 1 đến giai đoạn 6. Trước tiên, vỏ chuối được tách ra và cắt thành các miếng có kích thước khoảng 3cm. Sau đó, vỏ chuối được mang đi sấy đối lưu ở 55oC trong 12 giờ. Cuối cùng, vỏ chuối được nghiền thành bột mịn. Bột vỏ chuối sau khi nghiền được bảo quản trong túi zip, hút chân không và lưu trữ ở nhiệt độ phòng (Alireza Farrokh và cộng sự, 2018; Chanai Noysang và cộng sự, 2019)
Bảng 2.1. Bảng mơ tả màu sắc và hình ảnh thực tế của sáu mẫu chuối (Amit Verma và cộng sự, 2015)
Giai đoạn Mô tả màu sắc Ảnh thực nghiệm
1
(Mẫu M1) Màu xanh lá nhạt
2 (Mẫu M2)
Màu xanh lá nhạt với một ít vàng. Màu vàng chiếm từ 8% đến 25% tổng diện tích quả
3 (Mẫu M3)
Màu vàng với một ít xanh lá. Màu vàng chiếm từ 25% đến 50% tổng diện tích quả
4 (Mẫu M4)
Màu vàng, nhưng vẫn còn xanh ở hai đầu. Màu vàng chiếm từ 50% đến 85% tổng diện tích quả
5 (Mẫu M5)
Màu vàng chiếm trên 85% tổng diện tích quả
6 (Mẫu M6)
Màu vàng và xuất hiện đốm đen
2.2.3. Phương pháp chuẩn bị cao trích vỏ chuối
Bột vỏ chuối được trích ly bằng phương pháp ngâm dầm với dung môi là ethanol 96%. Tỉ lệ giữa bột vỏ chuối và ethanol là 1:3 (w/v). Hỗn hợp được ngâm trong 24 giờ và được lọc qua giấy lọc Advantec số 1 để thu dịch chiết. Bã sau khi lọc được ngâm tiếp trong ethanol với cùng điều kiện. Lặp lại quá trình ngâm thêm 3 lần để tận thu dịch trích. Sau đó tiến hành cơ quay với tốc độ 100 vòng/phút, nhiệt độ 50oC và sấy trong 24 giờ ở 40oC đến khối lượng khơng đổi. Bảo quản cao trích sau khi sấy trong bình thủy tinh tối màu ở nhiệt độ .
Hiệu suất của q trình trích ly được thực hiện bằng cách cân mẫu cao vỏ chuối sau khi sấy bằng cân phân tích (g). Hiệu suất thu hồi được tính theo cơng thức:
H = mcao
mbột×100 (%)
Trong đó: mcao là khối lượng cao trích vỏ chuối thu được sau khi sấy mbột là khối lượng bột vỏ chuối được mang đi trích ly
2.2.4. Phương pháp đánh giá thành phần và hoạt tính sinh học của cao trích vỏ chuối 2.2.4.1. Phương pháp xác định hàm lượng tổng hợp chất phenolic trong cao trích vỏ 2.2.4.1. Phương pháp xác định hàm lượng tổng hợp chất phenolic trong cao trích vỏ chuối
Nguyên tắc: Thuốc thử Folin-Ciocalteu chứa chất oxy hóa là acid phospho-vonframic
sẽ oxy hóa các nhóm hydroxy polyphenol tạo ra các acid heteroply màu xanh da trời có độ hấp thụ cực đại tại bước sóng 765 nm. Dựa vào độ hấp thụ, hàm lượng tổng hợp chất phenolic trong mẫu cao trích được xác định dựa vào đường chuẩn acid gallic (TCVN 9745-1, 2013).
Phương pháp xác định hàm lượng tổng hợp chất phenolic được tiến hành dựa trên tiêu chuẩn quốc gia TCVN 97451 với một số điều chỉnh cho phù hợp với điều kiện thí nghiệm. Cân chính xác 0,2000g mẫu cao trích cho vào ống chiết thuỷ tinh có nắp. Thêm 9,80 mL hỗn hợp dịch chiết nóng ethanol:nước (9:1) ở 70oC vào ống và trộn đều bằng máy trộn vortex trong 30 giây. Sau đó chuyển ống chiết chứa mẫu qua máy đánh siêu âm trong vòng 2 phút. Tiếp tục đun nóng ống chiết ở 70oC trong 10 phút tại bể điều nhiệt và trộn mẫu trên máy vortex sau mỗi 5 phút. Sau đó, tiến hành ly tâm với vận tốc 3500 rpm/phút trong 10 phút.