(Jeongmok Kim và cộng sự, 2000).
Tác nhân khử Tác nhân chứa sulfit
Acid ascorbic và các chất tương tự Cysteine glutathione
Tác nhân ức chế enzyme Các acid carboxylic chứa vòng thơm Aliphatic alcohol
Tác nhân acid hóa Acid citric Acid phosphoric
Tác nhân tạo phức Cyclodextrins
Tác nhân chelating Muối phosphate EDTA
Maltol Acid kojic
Kỹ thuật xử lý bằng enzyme Oxygenases
o-Methyl transferase Proteases
Trong các chất ức chế quá trình melanosis, sulfit và các dẫn xuất của sulfit, điển hình là SMS thường được sử dụng do mang lại hiệu quả cao (Tổng Cục Thủy Sản, 2017). Cơ chế kìm hãm phản ứng melanosis của SMS bao gồm: (i) SMS sẽ phản ứng với các hợp chất
(Obdulio J. Ferrer và cộng sự, 1989). Theo FDA (2019), sulfit an toàn đối với hầu hết mọi người nếu sử dụng đúng liều lượng. Nhưng nhiều báo cáo đã chỉ ra người mắc bệnh hen sẽ dễ xảy ra dị ứng với sulfit (Nilesh Prakash Nirmal và Soottawat Benjakul, 2011). Do đó một số quốc gia trên thế giới như Mỹ và EU đã yêu cầu dán nhãn dị ứng đối với các sản phẩm có chứa sulfit. Những nhãn dị ứng này có thể khiến người mua lo ngại về chất lượng sản phẩm, kể cả những người không bị dị ứng với sulfit (Tổng Cục Thủy Sản, 2017). Vì vấn đề sức khỏe cho người tiêu dùng và hạn chế những hiểu lầm do nhãn dị ứng gây ra, các chất bảo quản có nguồn gốc từ tự nhiên đang được nghiên cứu nhằm thay thế cho sulfit và các dẫn xuất của sulfit. Một trong số đó là những nghiên cứu ứng dụng các hợp chất phenolic có nguồn gốc từ thực vật (Thanasak Sae-leaw và Soottawat Benjakul, 2019a).
Các hợp chất phenolic được trích ly từ thực vật có khả năng ức chế enzyme PPO và ngăn chặn phản ứng melanosis ở động vật giáp xác thông qua các cơ chế khác nhau như: (i) cạnh tranh với cơ chất của PPO do cấu trúc tương tự (T Croguennec, 2016); (ii) tương tác với enzyme hoặc protein thông qua liên kết hydro hoặc liên kết kỵ nước (Tanja D. Cirkovic Velickovic và Dragana J. Stanic-Vucinic, 2018); (iii) Hơn nữa, các nhóm hydroxyl của hợp chất phenolic có khả năng nhường điện tử cho quinone, chấm dứt chuỗi phản ứng oxy hóa; (iv) Ngồi ra, các dẫn xuất phenolic cịn có khả năng tạo phức với các ion kim loại, đặc biệt là Cu2+ ở trung tâm hoạt động của PPO thông qua các liên kết hydro. Từ đó ức chế hoạt động của enzyme PPO (Isao Kubo và Ikuyo Kinst-Hori, 1998).
1.6. Một số nghiên cứu đã được tiến hành để đánh giá khả năng ứng dụng dịch trích ly từ thực vật trong q trình bảo quản tơm từ thực vật trong q trình bảo quản tơm
Hiện nay có nhiều cơng trình nghiên cứu ứng dụng dịch trích ly từ thực vật để bảo quản tôm thẻ chân trắng. Các nghiên cứu này sử dụng dịch trích ly từ các nguồn thực vật khác nhau và mang lại nhiều kết quả khả quan. Bảng 1.9 thống kê một số nghiên cứu nổi bật về khả năng sử dụng dịch trích ly từ thực vật trong việc bảo quản tơm.
Trong số các nghiên cứu đã thực hiện ở trên, dịch trích ly từ vỏ chuối cho thấy tiềm năng ứng dụng trong bảo quản tôm với nhiều ưu điểm nổi bật. Ở Việt Nam, chuối là cây được trồng phổ biến và sản lượng cao. Hơn nữa, vỏ chuối chứa nhiều các hợp chất phenolic có hoạt tính sinh học cao và có khả năng chống vi sinh vật (Rafaela González-Montelongo và cộng sự, 2010). Trong nghiên cứu gần đây, C. Noysang và cộng sự (2019) đã chỉ ra dịch trích ly từ vỏ chuối có khả năng ức chế tốt enzyme PPO. Từ đó mở ra cơ hội cho việc ứng dụng dịch trích ly từ vỏ chuối trong việc kiểm sốt q trình melanosis ở tơm sau thu hoạch.
Tuy nhiên, các nghiên cứu trước đó về vỏ chuối chỉ tập trung nghiên cứu định lượng hợp chất phenolic, so sánh hàm lượng các chất có hoạt tính sinh học có trong dịch trích giữa các giống chuối khác nhau hoặc điều kiện canh tác khác nhau mà chưa có một nghiên cứu nào mang tính chất tổng thể và đầy đủ theo các giai đoạn chín của chuối. Ngồi ra, vẫn chưa có biện pháp giải quyết phế phẩm trong quá trình sản xuất các sản phẩm thực phẩm có ngun liệu là chuối. Vì vậy, nghiên cứu này tập trung khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian chín đến sự thay đổi các tính chất chống oxy hóa và ức chế enzyme PPO trong vỏ chuối. Từ đó, nghiên cứu ứng dụng dịch trích ly này để bảo quản tơm thẻ chân trắng nhằm khảo sát đầu ra cho phế phẩm vỏ chuối.
Bảng 1.9. Một số nghiên cứu ứng dụng dịch trích ly từ thực vật để bảo quản tơm
Loại dịch trích Đối tượng Cách xử lý Nồng độ
tối ưu Tác giả
Dịch trích lá điều Tơm thẻ chân trắng Dịch trích lá điều 1% Sae-leaw và
Benjakul (2019)
Dịch trích vỏ cam Tơm thẻ chân trắng Ngâm trực tiếp 5% Vakili và
Ardakani (2018)
Dịch trích trà xanh Tơm thẻ chân trắng Ngâm trực tiếp và
kết hợp với chitosan
1% GTE Yuan và Sun
(2016)
Dịch trích vỏ lựu Tơm thẻ chân trắng Ngâm trực tiếp và
kết hợp với chitosan 1,5% dịch trích và 1% chitosan Yuan và Sun (2016)
Dịch trích vỏ lựu Tơm thẻ chân trắng Ngâm trực tiếp 1% Basiri và cộng sự
(2015)
Dịch trích quả sơ ri Tơm thẻ chân trắng Ngâm trực tiếp 2,5% Gonỗalves v
cng s (2015)
Dịch trích keo đậu Tôm thẻ chân trắng Ngâm trực tiếp 0,5% Nirmal và
Benjakul (2011) Dịch trích trà xanh
và trà dâu tằm
Tôm thẻ chân trắng Ngâm trực tiếp 0,5% Nirmal và
Benjakul (2011)
Dịch trích hạt nho Tơm hồng nước sâu Ngâm trực tiếp 1,5% Gokoglu và
CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu, hóa chất và dụng cụ thiết bị
2.1.1. Nguyên liệu
Các buồng chuối sứ sử dụng trong nghiên cứu được lấy từ chợ nơng sản Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam vào tháng 3, năm 2020 với cùng một tiểu thương.
2.1.2. Hóa chất
Tên hóa chất Nguồn gốc Số CAS
Ethanol (EtOH) 96% Chemsol, Việt Nam -
Dipotassium phosphate (K2HPO4) Xilong Chemical, Trung Quốc -
Monopotassium phosphate (KH2PO4) Xilong Chemical, Trung Quốc -
Potassium ferricyanide (K3[Fe(CN)6]) Xilong Chemical, Trung Quốc -
Ferric chloride (FeCl3) Xilong Chemical, Trung Quốc -
Sodium carbonate (Na2CO3) Xilong Chemical, Trung Quốc -
Acid hydrochloric (HCl) Xilong Chemical, Trung Quốc -
Sodium metabisulfit (SMS) Xilong Chemical, Trung Quốc -
Acid kojic (C6H6O4) Sigma-Aldrich, USA 501-30-4
Folin-Ciocalteu (FC) Sigma-Aldrich, USA 149-91-7
2,2-diphenyl-1-picryl hydrazyl (DPPH) Sigma-Aldrich, USA 1898-66-4
Acid gallic (C7H6O5) Sigma-Aldrich, USA 5995-86-8
L-3,4-Dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) Sigma-Aldrich, USA 59-92-7
Acid thiobarbituric (TBA) Sigma-Aldrich, USA 504-17-6
Malondialdehyde (MDA) Eagle Biosciences, USA 100683-54-3
Acid trichloroacetic (TCA) Merck, Đức 76-03-9
2.1.3. Dụng cụ và thiết bị
Tên dụng cụ, thiết bị Nguồn gốc
Các dụng cụ thí nghiệm cơ bản Duran, Đức
Cuvet thủy tinh Trung Quốc
Giấy lọc Số 1, Advantec, Nhật Bản
pH kế Mettler Toledo AG 8603 SevenEasy, Đức
Cân phân tích 4 số LX220A, Precisa, Thuỵ Sỹ Máy quang phổ UV-Vis UH-5300, Hitachi, Nhật Bản
Tủ sấy UN55, Memmert, Đức
Bể điều nhiệt WNB14, Memmert, Đức
Bể đánh siêu âm S 100 H, Elmasonic, Đức
Thiết bị cô quay RE 301A-W, Yamato, Nhật Bản Thiết bị đồng hóa T 25 Digital Ultra-turrax, IKA, Đức
Thiết bị ly tâm Z 206A, Hermle, Đức
Hệ thống sắc ký lỏng siêu cao áp - Bộ bơm mẫu trực tiếp bằng
Syringe KdScientifit, USA
- Hệ thống khối phổ MS/MS Bruker, Germany
2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu
Buồng chuối
Lấy quả theo kế hoạch
Tách vỏ, bỏ cuống đen ở đầu quả
Xử lý tạo thành bột vỏ chuối (BPP)
Ngâm BPP trong ethanol 96%. Tỉ lệ 1 BPP : 3 ethanol (w/v). Lặp lại 3 lần, mỗi lần 24 giờ
Xử lý tạo thành cao trích vỏ chuối (BPE)
Phân tích mẫu Xác định thành phần hóa học Xác định hoạt tính TPC; HPLC – MS. Ức chế DPPH; Năng lực khử Fe3+về Fe2+ ; Ức chế enzyme PPO. Ứng dụng trên tôm
Tôm thẻ chân trắng (sống) được lấy từ chợ Thủ Đức (30-35 con/kg)
Bảo quản trong tủ lạnh với nhiệt độ từ 1-3oC cho tới khi sử dụng (thời gian bảo quản tối đa 1 giờ)
Rửa lại bằng nước lạnh và để ráo
Ngâm BPE 0,1% với tỉ lệ tôm:dung dịch là 1:2 (w/v) Ngâm BPE 0,5% với tỉ lệ tôm:dung dịch là 1:2 (w/v) Ngâm BPE 1% với tỉ lệ tôm:dung dịch là 1:2 (w/v)
Ngâm nước với tỉ
lệ tôm:nước là 1:2 (w/v) (mẫu đối chứng) Bảo quản lạnh ở 1-3o C Phân tích mẫu
Chỉ tiêu vi sinh Chỉ tiêu hóa học Đánh giá melanosis
Tổng VSV hiếu khí; P. aeruginosa; VSV kị khí khử sulfit. pH thịt tôm; TVB-N; TBARS.
Thuyết minh quy trình
Giai đoạn 1: Chuối sau khi mua về từ chợ nơng sản Thủ Đức được để chín tự nhiên. Sau đó, chuối được tách ruột và xử lý tạo thành 6 mẫu bột vỏ chuối tương ứng với 6 giai đoạn chín. Tiếp theo ngâm bột vỏ chuối trong ethanol 96% bằng phương pháp ngâm dầm rồi lọc để thu dịch. Hỗn hợp dịch được cô quay và sấy tới khối lượng khơng đổi để tạo thành cao trích vỏ chuối. Tương ứng với 6 giai đoạn chín của chuối là 6 mẫu cao trích.
Giai đoạn 2: Các mẫu cao trích vỏ chuối sẽ được đánh giá các chỉ tiêu bao gồm hàm lượng TPC, khả năng ức chế DPPH, năng lực khử Fe3+ về Fe2+ và khả năng ức chế enzyme PPO để lựa chọn mẫu cao trích tối ưu, phù hợp cho ứng dụng bảo quản tôm thẻ chân trắng. Mẫu cao trích tối ưu sẽ tiếp tục được phân tích HPLC để định tính sơ bộ thành phần hóa học. Giai đoạn 3: Tơm được xử lý với mẫu cao trích vỏ chuối được lựa chọn ở giai đoạn 2 tại các nồng độ khác nhau. Sau đó, các mẫu tơm được đánh giá các chỉ tiêu như pH thịt tơm, q trình melanosis, chỉ số oxy hóa TBARS để lựa chọn nồng độ cao trích tối ưu cho việc bảo quản tôm. Cuối cùng, mẫu cao trích có nồng độ tối ưu được phân tích thêm chỉ tiêu vi sinh vật và TVB-N trong điều kiện bảo quản lạnh.
2.2.2. Phương pháp xử lý tạo bột vỏ chuối
Chuối được để chín tự nhiên và phân thành sáu giai đoạn chín. Mỗi giai đoạn chín, chuối sẽ được lấy với số lượng từ 20 đến 25 quả/buồng và được kí hiệu theo thứ tự từ M1 tới M6, tương ứng với chuối ở giai đoạn 1 đến giai đoạn 6. Trước tiên, vỏ chuối được tách ra và cắt thành các miếng có kích thước khoảng 3cm. Sau đó, vỏ chuối được mang đi sấy đối lưu ở 55oC trong 12 giờ. Cuối cùng, vỏ chuối được nghiền thành bột mịn. Bột vỏ chuối sau khi nghiền được bảo quản trong túi zip, hút chân không và lưu trữ ở nhiệt độ phòng (Alireza Farrokh và cộng sự, 2018; Chanai Noysang và cộng sự, 2019)
Bảng 2.1. Bảng mơ tả màu sắc và hình ảnh thực tế của sáu mẫu chuối (Amit Verma và cộng sự, 2015)
Giai đoạn Mô tả màu sắc Ảnh thực nghiệm
1
(Mẫu M1) Màu xanh lá nhạt
2 (Mẫu M2)
Màu xanh lá nhạt với một ít vàng. Màu vàng chiếm từ 8% đến 25% tổng diện tích quả
3 (Mẫu M3)
Màu vàng với một ít xanh lá. Màu vàng chiếm từ 25% đến 50% tổng diện tích quả
4 (Mẫu M4)
Màu vàng, nhưng vẫn còn xanh ở hai đầu. Màu vàng chiếm từ 50% đến 85% tổng diện tích quả
5 (Mẫu M5)
Màu vàng chiếm trên 85% tổng diện tích quả
6 (Mẫu M6)
Màu vàng và xuất hiện đốm đen
2.2.3. Phương pháp chuẩn bị cao trích vỏ chuối
Bột vỏ chuối được trích ly bằng phương pháp ngâm dầm với dung môi là ethanol 96%. Tỉ lệ giữa bột vỏ chuối và ethanol là 1:3 (w/v). Hỗn hợp được ngâm trong 24 giờ và được lọc qua giấy lọc Advantec số 1 để thu dịch chiết. Bã sau khi lọc được ngâm tiếp trong ethanol với cùng điều kiện. Lặp lại quá trình ngâm thêm 3 lần để tận thu dịch trích. Sau đó tiến hành cơ quay với tốc độ 100 vòng/phút, nhiệt độ 50oC và sấy trong 24 giờ ở 40oC đến khối lượng khơng đổi. Bảo quản cao trích sau khi sấy trong bình thủy tinh tối màu ở nhiệt độ .
Hiệu suất của q trình trích ly được thực hiện bằng cách cân mẫu cao vỏ chuối sau khi sấy bằng cân phân tích (g). Hiệu suất thu hồi được tính theo cơng thức:
H = mcao
mbột×100 (%)
Trong đó: mcao là khối lượng cao trích vỏ chuối thu được sau khi sấy mbột là khối lượng bột vỏ chuối được mang đi trích ly
2.2.4. Phương pháp đánh giá thành phần và hoạt tính sinh học của cao trích vỏ chuối 2.2.4.1. Phương pháp xác định hàm lượng tổng hợp chất phenolic trong cao trích vỏ 2.2.4.1. Phương pháp xác định hàm lượng tổng hợp chất phenolic trong cao trích vỏ chuối
Nguyên tắc: Thuốc thử Folin-Ciocalteu chứa chất oxy hóa là acid phospho-vonframic
sẽ oxy hóa các nhóm hydroxy polyphenol tạo ra các acid heteroply màu xanh da trời có độ hấp thụ cực đại tại bước sóng 765 nm. Dựa vào độ hấp thụ, hàm lượng tổng hợp chất phenolic trong mẫu cao trích được xác định dựa vào đường chuẩn acid gallic (TCVN 9745-1, 2013).
Phương pháp xác định hàm lượng tổng hợp chất phenolic được tiến hành dựa trên tiêu chuẩn quốc gia TCVN 97451 với một số điều chỉnh cho phù hợp với điều kiện thí nghiệm. Cân chính xác 0,2000g mẫu cao trích cho vào ống chiết thuỷ tinh có nắp. Thêm 9,80 mL hỗn hợp dịch chiết nóng ethanol:nước (9:1) ở 70oC vào ống và trộn đều bằng máy trộn vortex trong 30 giây. Sau đó chuyển ống chiết chứa mẫu qua máy đánh siêu âm trong vòng 2 phút. Tiếp tục đun nóng ống chiết ở 70oC trong 10 phút tại bể điều nhiệt và trộn mẫu trên máy vortex sau mỗi 5 phút. Sau đó, tiến hành ly tâm với vận tốc 3500 rpm/phút trong 10 phút. Lấy 0,20 mL dịch nổi bên trên ống chiết cho vào ống nghiệm, thêm 9,80 mL nước cất (pha lỗng 50 lần). Sau đó, tiến hành lấy 1,30 mL dung dịch mẫu đã được pha loãng vào ống nghiệm 10 mL. Thêm 1,00 mL thuốc thử Folin-Ciocalteu 20% vào ống, lắc đều và để yên 5 phút. Tiếp tục thêm vào 700 µL Na2CO3 10%, để yên 30 phút trong bóng tối. Tiến hành đo độ hấp thụ trên máy đo UV-Vis ở bước sóng 760 nm. Mẫu đối chứng được chuẩn bị theo cách tương tự nhưng thay dung dịch cao trích ban đầu bằng hỗn hợp ethanol:nước (9:1). Kết quả hàm lượng tổng hợp chất phenolic được tính và thể hiện dưới dạng mg GAE/g chất khơ.
Cao trích vỏ chuối Định lượng Phối trộn 1 Gia nhiệt Ly tâm Pha loãng Phối trộn 2 Ethanol:nước (9:1) Folin 20% Na2CO3 Đặt trong bóng tối Kết quả Đo độ hấp thụ ở 760 nm
Hình 2.3. Sơ đồ quy trình xác định hàm lượng tổng hợp chất phenolic
2.2.4.2. Phương pháp đánh giá khả năng ức chế gốc tự do DPPH trong cao trích vỏ chuối chuối
Ngun tắc: Dung dịch DPPH có màu đỏ tía hấp thụ cực đại tại bước sóng 517 nm.
Các chất chống oxy hóa sẽ trung hịa gốc tự do DPPH bằng cách cho hydrogen, làm giảm độ hấp thụ tại bước sóng cực đại và màu của dung dịch phản ứng nhạt dần. Dung dịch này sẽ chuyển từ màu đỏ tía sang màu vàng nhạt. Giá trị mật độ quang càng thấp chứng tỏ khả năng bắt gốc tự do DPPH càng cao (TCVN 11939, 2017).
Phương pháp đánh giá khả năng ức chế gốc tự do DPPH của cao trích được xác định theo phương pháp của Yin Yin Tun và cộng sự (2019) với một số thay đổi để phù hợp với điều kiện phịng thí nghiệm. Cân 0,0100g cao trích vỏ chuối cho vào ống nghiệm thủy tinh có nắp. Thêm 9,99 mL nước cất vào ống và trộn đều bằng máy trộn vortex trong 30 giây. Sau đó chuyển ống nghiệm chứa mẫu qua máy đánh siêu âm trong vịng 3 phút. Pha lỗng hỗn hợp dung dịch cao trích theo các nồng độ khác nhau (10, 25, 50, 100 µg/mL). Lấy 1,5 mL mẫu dung dịch cao trích đã được pha lỗng trộn với 1,5 ml DPPH 0,15 mM (DPPH được pha trong ethanol 96%). Lắc mạnh hỗn hợp và đặt trong bóng tối 30 phút ở nhiệt độ phịng. Sau đó dung dịch được đo độ hấp thụ ở bước sóng 517 nm. Mẫu đối chứng ở mỗi nồng độ được chuẩn bị theo cách tương tự nhưng thay dung dịch cao trích bằng ethanol 96%. Acid gallic được sử dụng làm chất chuẩn (Yin Yin Tun và cộng sự, 2019).
Cao trích vỏ chuối Phối trộn Đặt trong