Hợp chất KC15 thu được ở dạng bột màu trắng.
Trên phổ 1H-NMR của KC15 cho thấy các tín hiệu quan trọng của 1 nhóm methyl bậc 2 tại δH 0,97 (d; J = 4.65 Hz, H-18); 5 nhóm methyl bậc 3 tại δH 0,89 (s; H-28); 0,97 (d; J = 4,4; H-18 và H-21); 1,36 (s; H-29) và 1,91 (s; H-27); 3 proton olefinic tại δH 5,94 (d; J = 12,6 Hz; H-2); 6,14 (d; J = 12,6 Hz; H-1) và 6,61 (d; J = 4,8 Hz; H-24) và 1 nhóm oxymethine tại δH 4,46 (d; J = 13,2 Hz; H-22).
Phổ 13C-NMR cho thấy sư xuất hiện của 30 nguyên tử carbon bao gồm 6 nhóm methyl, 8 nhóm methylene, 8 nhóm methine và 8 ngun tử carbon khơng liên kết với proton. Trong đó nổi bật là tín hiệu của 2 nhóm carbonyl tại δC 167,5 (C-3) và 166,7 (C-26), 4 nguyên tử carbon khơng bão hịa tại δC 150,8 (C-1); 139,5 (C-24); 128,4 (C-25) và 120,4 (C-2), 2 carbon liên kết với oxy tại δC 84,7 (C-4) và 80,6 (C- 22), và 6 nhóm methyl tại δC 29,0 (C-29); 22,2 (C-30); 19,1 (C-28); 17,3 (C-27); 17,2 (C-18) và 13,3 (C-21).
Các dữ kiện trên cho thấy KC15 có cấu trúc của mợt triterpenoid khung 3,4- secocycloartane [86].
So sánh dữ liệu phổ của KC15 với hợp chất schisanlactone B đã cơng bớ [86] nhận thấy có sư phù hợp về tín hiệu phổ tại các vị trí tương ứng (bảng 4.2.15). Kết hợp với các dữ kiện phổ HMQC và HMBC cho phép khẳng định hợp chất KC15 là
Bảng 4.2.15. Số liệu phổ NMR của hợp chất KC15 và hợp chất tham khảo
Vị trí C #δC δCa,b DEPT δHa,cđộ bội, (J = Hz) HMBC
1 150,4 150,8 CH 6,14 d (12,6) 2, 3, 5 2 120,5 120,4 CH 5,94 d (12,6) 1 3 167,3 167,5 C - 4 84,5 84,7 C - 5 46,4 46,3 CH 2,42 t (16,0) 4, 6 6 24,5 24,5 CH2 0,8 m/1,89 m 7 29,0 28,8 CH2 1,37 m 8 45,1 45,1 CH 1,8 m 9 33,5 33,5 C - 10 28,7 28,8 C - 11 32,1 32,3 CH2 1,21 m 12 32,6 32,5 CH2 1,02 m/1,69 m 13 48,7 48,7 C - 14 45,6 45,6 C - 15 26,9 27,0 CH2 1,43 m 16 35,1 35,0 CH2 1,34 m 17 48,1 48,1 CH 1,59 m/1,63 m 18 17,0 17,2 CH3 0,97 d (4,4) 13 19 24,1 24,1 CH2 1,02 m/1,22 m 20 39,2 39,2 CH 2,03 m 21 13,2 13,3 CH3 0,97 d (4,4) 22 22 80,5 80,6 CH 4,46 d (13,2) 23 23,6 23,6 CH2 2,1 m/2,35 m 24 139,2 139,5 CH 6,61 d (4,8) 22, 26 25 128,5 128,4 C - 26 166,4 166,7 C - 27 17,2 17,3 CH3 1,91 s 24, 25, 26 28 19,0 19,1 CH3 0,89 s 8, 14, 15 29 29,2 29,0 CH3 1,36 s 30 22,1 22,2 CH3 1,36 s
#δC của schisanlactone B [86] đo trong chloroform-d1, achloroform-
d1, b100 MHz, c400 MHz
Như vậy từ thân và lá cây Na rừng đã phân lập được 15 hợp chất với 3 hợp chất mới là: kadcoccilactone V (KC3), kadsuracin A (KC5), (S)-1-phenylethyl-6-α-
L-arabinopyranosyl-β-D-glucopyranoside (KC7) và 12 hợp chất đã biết là:
+ Nortriterpenoid: Kadnanolactone H (KC1), micrandiactone H (KC2), kadnanolactone I (KC4).
+ Lignan: Interiotherin C (KC6).
+ Phenolic glycoside: 3,4-dihydroxyphenylethanol-5-O-β-D-glucose (KC8), Cimidahurinine (KC9), thalictoside (KC10), icariside E3 (KC11), phloridzin (KC12).
+ Triterpenoid khung seco-lanostane: Seco-coccinic acid A (KC13), seco- coccinic acid F (KC14).
+ Triterpenoid khung 3,4-secocycloartane: Schisanlactone B (KC15).
Trong số các hợp chất cũ thì thalictoside lần đầu tiên được phân lập từ loài thưc vật này, các chất còn lại đều đã được phân lập từ chi Kadsura Juss.
Hình 4.2.16. Cấu trúc các chất phân lập từ lồi Na rừng (K. coccinea)
4.3. Đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập được
4.3.1. Hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập được từ lồi Thơng đất (L. cernua)
4.3.1.1. Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế sản sinh nitric oxide (NO)
Các hợp chất thu được từ loài Thơng đất được đánh giá hoạt tính ức chế sản sinh NO trên tế bào BV2 được kích thích bởi LPS.
Đầu tiên, các chất được sàng lọc hoạt tính gây đợc tế bào BV2 kích thích bởi LPS theo phương pháp MTT, kết quả cho thấy tất cả các hợp chất đều không gây độc tế
bào ở nồng đợ 80µM. Sử dụng giá trị nồng đợ này các hợp chất tiếp tục được thử nghiệm hoạt tính ức chế NO bằng phương pháp Griess. Kết quả thu được như sau:
Bảng 4.3.1.1. Khả năng ức chế sản sinh NO của các hợp chất LC1-LC20 trên tế bào BV2 kích thích bởi LPS STT Hợp chất Giá trị IC50 (µM) 1 LC1 >100 2 LC2 50,5 ± 2,5 3 LC3 21,2 ± 1,1 4 LC4 40,5 ± 2,0 5 LC5 28,5 ± 1,4 6 LC6 >100 7 LC7 79,6 ± 4,0 8 LC8 64,0 ± 3,2 9 LC9 >100 10 LC10 59,4 ± 3,0 11 LC11 51,0 ± 2,6 12 LC12 49,0 ± 2,5 13 LC13 46,2 ± 2,3 14 LC14 52,0 ± 2,6 15 LC15 68,6 ± 3,4 16 LC16 30,1 ± 1,5 17 LC17 36,8 ± 1,8 18 LC18 57,7 ± 2,9 19 LC19 48,8 ± 2,2 20 LC20 49,2 ± 2,5 21 Butein* 4,5 ± 0,2 *-chất đối chứng dương
Từ bảng kết quả trên cho thấy các hợp chất LC3, LC5 có khả năng ức chế sản sinh NO với giá trị IC50 lần lượt là 21,2 ± 1,1; 28,5 ± 1,4 µM.
4.3.1.2. Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư
Tất cả 20 hợp chất phân lập từ loài Thơng đất được thử hoạt tính gây đợc tế bào trên 3 dịng tế bào ung thư người bao gồm MCF7 (ung thư vú), HepG2 (ung thư gan) và SK-Mel-2 (khới u ác tính) bằng phương pháp SRB.
Bảng 4.3.1.2. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất LC1-LC20
Hợp chất Dịng tế bào IC50 (µM) HepG2 MCF7 SK-Mel2 LC1 >100 >100 >100 LC2 74,54±3,78 69,74±4,26 54,94±2,17 LC3 >100 >100 >100 LC4 >100 >100 >100 LC5 >100 >100 >100 LC6 >100 >100 >100 LC7 47,97±2,53 44,85±2,16 69,64±2,97 LC8 >100 >100 >100
LC9 >100 >100 >100 LC10 67,36± 4,14 51,79±2,47 73,62± 5,58 LC11 46,28±2,87 43,76±1,09 82,63±1,47 LC12 >100 >100 >100 LC13 >100 >100 >100 LC14 >100 >100 >100 LC15 53,81±4,84 62,97±3,03 85,46± 3,63 LC16 84,77±4,86 54,55±3,15 92,25±4,58 LC17 >100 >100 >100 LC18 >100 >100 >100 LC19 >100 >100 >100 LC20 46,28±2,87 43,76±1,09 82,63±1,47 *Ellipticine 0,46± 0,05 0,36± 0,04 0,53± 0,05 *-chất đối chứng dương
Kết quả cho thấy hợp chất LC7 cho hoạt tính ức chế trung bình trên cả 3 dịng tế bào ung thư được thử với giá trị IC50 lần lượt là 44,85 ± 2,16; 47,97 ± 2,53 và 69,64 ± 2,97 µM đới với MCF7; HepG2 và SK-Mel-2. Hợp chất LC16 cho hoạt tính ức chế ́u trên 3 dịng tế bào này này với giá trị IC50 lần lượt là 54,55 ± 3,15; 84,77 ± 4,86 và 92,25 ± 4,58 µM.
4.3.2. Hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập được từ loài Na rừng (K. coccinea)
4.3.2.1. Kết quả sàng lọc hoạt tính ức chế sản sinh nitric oxide (NO)
Các hợp chất thu được từ lá của Na rừng (KC5-KC12) được đánh giá hoạt tính ức chế sản sinh NO trên tế bào RAW264.7 được kích thích bởi LPS.
Đầu tiên, các chất được sàng lọc hoạt tính gây đợc tế bào RAW264.7 kích thích bởi LPS theo phương pháp MTT, kết quả cho thấy tất cả các hợp chất đều không gây độc tế bào ở nồng đợ 50 µM. Sử dụng giá trị nồng độ này, các hợp chất tiếp tục được thử nghiệm hoạt tính ức chế NO bằng phương pháp Griess. Kết quả thu được như sau:
Bảng 4.3.2.1. Khả năng ức chế sản sinh NO của các hợp chất KC5-KC12 trên tế bào RAW264.7 kích thích bởi LPS
STT Hợp chất Giá trị IC50 (µM) 1 KC5 10,2 ± 0,66 2 KC6 21,7 ± 1,22 3 KC7 > 50 4 KC8 > 50 5 KC9 > 50 6 KC10 > 50 7 KC11 > 50 8 KC12 > 50 9 *Dexamethasone 0,01 ± 0,00 *chất đối chứng dương
Từ bảng kết quả trên cho thấy các hợp chất KC5, KC6 có khả năng ức chế sản sinh NO với giá trị IC50 lần lượt là 10,2 ± 0,66 và 21,7 ± 1,22 µM.
4.3.2.2. Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế sinh trưởng tế bào ung thư
Các hợp chất phân lập từ thân cây Na rừng (KC1-KC4, KC13-KC15) được thử hoạt tính ức chế sinh trưởng tế bào trên 6 dịng tế bào ung thư người bao gồm HCT- 15 (ung thư đại tràng), NUG-3 (ung thư dạ dày), NCI-H23 (ung thư phổi), ACHN (ung thư thận), PC-3 (ung thư tuyến tiền liệt), MDA-MB-231 (ung thư vú) bằng phương pháp SRB sử dụng adriamycin làm chất đối chứng. Kết quả được thể hiện trong bảng sau:
Bảng 4.3.2.2. Kết quả thử hoạt tính ức chế sinh trưởng tế bào của các hợp chất
KC1-KC4 và KC13-KC15
Hợp chất
Dòng tế bào, IC50 (μM)
HCT-15 NUGC-3 NCI-H23 ACHN PC-3 MDA-MB-
231 KC1 > 30 > 30 > 30 > 30 > 30 > 30 KC2 > 30 > 30 > 30 > 30 > 30 > 30 KC3 > 30 > 30 > 30 > 30 > 30 > 30 KC4 > 30 > 30 > 30 > 30 > 30 > 30 KC13 > 30 > 30 > 30 > 30 > 30 > 30 KC14 > 30 > 30 > 30 > 30 > 30 > 30 KC15 2,67 ± 0,02 1,80 ± 0,02 1,28 ± 0,01 2,63 ± 0,01 2,33 ± 0,01 2,38 ± 0,02 *Adriamycin 0,07 ± 0,01 0,07 ± 0,01 0,07 ± 0,01 0,07 ± 0,01 0,07 ± 0,01 0,08 ± 0,01 *-chất đối chứng dương
Từ kết quả này cho thấy hợp chất KC15 cho khả năng ức chế sinh trưởng mạnh trên dòng tế bào ung thư phổi (NCI-H23) với giá IC50 là 1,28 ± 0,01 µM, và ức chế tớt với sư sinh trưởng của 5 dòng tế bào ung thư còn lại với giá trị IC50 lần lượt là 2,67 ± 0,02 (HCT-15); 1,80 ± 0,02 (NUGC-3); 2,63 ± 0,01 (ACHN); 2,33 ± 0,01 (PC-3) và 2,38 ± 0,02 (MDA-MB-231) µM.
*Nhận xét:
Các hợp chất LC3, LC5, KC5, KC6 có hoạt tính ức chế sản sinh NO. Về mặt cấu trúc, đây là các hợp chất lignan – nhóm hợp chất được ghi nhận có hoạt tính ức chế sản sinh NO mạnh trong các nhóm chất hữu cơ.
Trong các chất có cùng khung là LC2, LC3, LC4, LC5, sư khác biệt của LC3 so với các hợp chất cịn lại là sư có mặt của nhóm -COCH3 tại vị trí C-1′. Ngoài ra, hợp chất LC5 có gớc β-D-glucoside tại vị trí C-4, trong khi các hợp chất khác khơng có. Kết quả trên gợi ý sư có mặt của nhóm -COCH3 gắn với C-1′ và gớc β-D- glucoside gắn với C-4 ảnh hưởng đến hoạt tính ức chế NO của các lignan với bộ khung này.
Về hoạt tính gây đợc tế bào, hợp chất LC7 là mợt serratane triterpenoid. Khi so sánh với các chất cùng bộ khung là LC8, LC9, LC14, điểm khác biệt là cấu hình tại vị trí C-21. Trong khi ở LC7 là nhóm β-OH thì các hợp chất còn lại là α-OH. Kết quả trên gợi ý vai trị của nhóm β-OH gắn với C-21 đới với hoạt tính gây đợc tế bào ở các serratane triterpenoid có cùng bợ khung.
Với hoạt tính ức chế sinh trưởng tế bào ung thư, hợp chất KC15 thể hiện hoạt tính tớt nhất. Đây là hợp chất duy nhất tḥc bộ khung này được phân lập từ Na
rừng nên chưa đủ cơ sở để gợi ý về liên quan cấu trúc, tác dụng của nó. Tuy nhiên, dưa trên tài liệu tham khảo về mợt sớ chất có cấu trúc tương tư [87, 88], có thể thấy vịng lactone 7 cạnh của KC15 có vai trị quan trọng trong hoạt tính của hợp chất này.
KẾT LUẬN
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Trong quá trình thưc hiện luận án này, chúng tôi đã thu được những kết quả nghiên cứu về loài Thông đất (Lycopodiella cernua (L.) Pic. Serm.), Na rừng
Kadsura coccinea (Lem.) A. C. Sm.), cụ thể như sau:
1. Về thành phần hóa học:
Đã phân lập và xác định được 35 hợp chất sạch từ các loài thưc vật này, trong đó: - Từ lồi Thơng đất: Có 20 hợp chất (LC1-LC10) với 3 hợp chất mới là lycocernuside E (LC1), lycernuic B (LC6) và lycernuic ketone F (LC7) và 17
hợp chất đã biết tḥc các nhóm chất: lignan (LC2-LC5), serratane triterpenoid (LC8 -LC14), flavonoid (LC15-LC17), cernuane triterpenoid (LC18-LC20).
- Từ loài Na rừng: Có 15 hợp chất (KC1-KC15) với 3 hợp chất mới là kadcoccilactone V (KC3), kadsuracin A (KC5), (S)-1-phenylethyl-6-α-L- arabinopyranosyl-β-D-glucopyranoside (KC7) và 12 hợp chất đã biết tḥc các
nhóm chất: nortriterpenoid (KC1-KC4), lignan (KC6), phenolic glycoside (KC8-
KC12), seco-lanostane triterpenoid (KC13-KC14), 3,4-secocycloartane triterpenoid
(KC15). Trong đó hợp chất thalictoside (KC10) lần đầu tiên được phân lập từ loài thưc vật này
2. Về hoạt tính sinh học
Các hợp chất sạch được thử hoạt tính sinh học ức chế sản sinh NO và gây độc tế bào ung thư. Kết quả cho thấy:
*Hoạt tính ức chế sản sinh NO
20 hợp chất từ cây Thông đất (LC1-LC20) được đánh giá hoạt tính ức chế sản sinh NO trên tế bào BV2 kích thích bởi LPS. Trong đó các hợp chất LC3, LC5 có khả năng ức chế sản sinh NO với giá trị IC50 lần lượt là 21,2 ± 1,1; 28,5 ± 1,4 µM.
8 hợp chất từ cây Na rừng (KC5-KC12) được đánh giá hoạt tính ức chế sản sinh NO trên tế bào RAW264.7 kích thích bởi LPS. Các hợp chất KC5, KC6 có khả năng ức chế sản sinh NO với giá trị IC50 lần lượt là 10,2 ± 0,66 và 21,7 ± 1,22 µM.
*Hoạt tính gây độc tế bào ung thư
20 hợp chất của cây Thông đất (LC1-LC20) được thử hoạt tính gây đợc tế bào trên 3 dịng tế bào ung thư người là MCF7 (ung thư vú), HepG2 (ung thư gan) và SK-Mel-2 (khới u ác tính). Hợp chất LC7 cho hoạt tính ức chế tớt trên cả 3 dịng tế bào ung thư được thử với giá trị IC50 lần lượt là 44,85 ± 2,16; 47,97 ± 2,53 và 69,64 ± 2,97 µM đới với MCF7; HepG2 và SK-Mel-2. Hợp chất LC16 cho hoạt tính ức chế yếu trên 3 dòng tế bào này này với giá trị IC50 lần lượt là 54,55 ± 3,15; 84,77 ± 4,86 và 92,25 ± 4,58 µM.
*Hoạt tính ức chế sinh trưởng tế bào ung thư
7 hợp chất của cây Na rừng (KC1-KC4, KC13-KC15) được thử hoạt tính ức chế sinh trưởng tế bào trên 6 dòng tế bào ung thư là HCT-15 (ung thư đại tràng), NUG- 3 (ung thư dạ dày), NCI-H23 (ung thư phổi), ACHN (ung thư thận), PC-3 (ung thư tuyến tiền liệt), MDA-MB-231 (ung thư vú). Trong đó, hợp chất KC15 cho khả năng ức chế mạnh trên dòng tế bào ung thư phổi (NCI-H23) với giá trị IC50 là 1,28 ± 0,01, và ức chế tốt với sư phát triển của 5 dòng tế bào ung thư còn lại với giá trị
IC50 lần lượt là 2,67 ± 0,02 (HCT-15); 1,80 ± 0,02 (NUGC-3); 2,63 ± 0,01 (ACHN); 2,33 ± 0,01 (PC-3) và 2,38 ± 0,02 (MDA-MB-231) µM.
KIẾN NGHỊ
Trên cơ sở các kết quả thu được, chúng tôi kiến nghị:
1. Hợp chất KC15 cho khả năng ức chế sinh trưởng mạnh trên dòng tế bào ung thư phổi (NCI-H23) với giá trị IC50 là 1,28 ± 0,01, và ức chế tốt với sư phát triển của 5 dòng tế bào ung thư với giá trị IC50 lần lượt là 2,67 ± 0,02 (HCT-15); 1,80 ± 0,02 (NUGC-3); 2,63 ± 0,01 (ACHN); 2,33 ± 0,01 (PC-3) và 2,38 ± 0,02 (MDA- MB-231) µM. Vì vậy, cần có nghiên cứu sâu hơn để định hướng cho thưc nghiệm
in vivo.
2. Khảo sát thêm hoạt tính sinh học khác với các chất mới đã phân lập nhằm tìm kiếm thêm khả năng ứng dụng của các hợp chất này.
DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ CỦA LUẬN ÁN
1. Le Huyen Tram, Tran Thu Huong, Le Thi Thuy, Nguyen Van Thong, Nguyen Tuan Anh, Nguyen Hoang Minh, Tran Thu Ha, Dao Anh Dung, Nguyen Phuong Thao, Phuong Thien Thuong, Duc Dat Le, Nguyen Dinh Hiep and Hee Jae Shin (2021). A new triterpenoid from the stems of Kadsura coccinea with
antiproliferative activity, Natural Product Research, https://doi.org/10.1080/14786419.2021.1914612.
2. Huyen Tram Le, Thu Huong Tran, Thi Thuy Le, Van Thong Nguyen, Tuan Anh Nguyen, Hoang Minh Nguyen, Thi Minh Tran, Thi Hong Phuong Nguyen, Thu Ha Tran, Hai Dang Nguyen, Duc Dat Le, Phuoc Dien Pham, Mina Lee (2021). A
new phenylethyl glycoside and a new dibenzocyclooctadiene lignan from the leaves of Kadsura coccinea (Lem.) A. C. Smith. Phytochemistry Letters,
https://doi.org/10.1016/j.phytol.2021.09.013.
3. Vu Huong Giang, Le Thi Thuy, Pham Thi Cham, Le Ba Vinh, Ninh Khac Ban, Tran My Linh, Nguyen Chi Mai, Pham Thi Hoe, Tran Thu Huong, Nguyen Hai Dang, Hyuncheol Oh, Tran Hong Quang (2021). Chemical constituents from
Lycopodiella cernua and their anti-imflammatory and cytotoxic activities.
Natural Product Research, https://doi.org/10.1080/14786419.2021.1958807. 4. Vu Huong Giang, Le Thi Thuy, Pham Thi Cham, Le Ba Vinh, Ninh Khac Ban,
Tran My Linh, Nguyen Chi Mai, Pham Thi Hoe, Tran Thu Huong, Nguyen Hai Dang, Tran Hong Quang (2021). Alkaloids and flavonoids from Lycopodiella
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] Võ Văn Chi (2012), "Từ điển cây thuốc Việt Nam", NXB Y học, Hà nội.
[2] Zhengyi Wu, Peter H. Raven (2013), "Lycopodiaceae through
Polypodiaceae", Flora of China, 2-3, Missouri Botanical Garden Press,
China.
[3] Nguyễn Tiến Bân (2003), "Danh mục các lồi thực vật Việt Nam", (2), NXB Nơng nghiệp, Hà Nội.
[4] Xiaoqiang Ma, David R. Gang (2004), "The Lycopodium alkaloids", Natural Product Reports, 21, 752-772.
[5] Fu-Wei Zhao, Qian-Yun Sun, Fu-Mei Yang, Guang-Wan Hu, Ji-Feng Luo, Gui-Hua Tang, Yue-Hu Wang, Chun-Lin Long (2010), "Palhinine A, a Novel
Alkaloid from Palhinhaea cernua", Organic Letters, 12, 3922-3925.
[6] Fu-Wei Zhao, Ji-Feng Luo, Yue-Hu Wang, Qian-Yun Sun, Fu-Mei Yang, Fang Liu, Chun-Lin Long (2012), "Lycopodium alkaloids from Palhinhaea
cernua", Journal of the Brazilian Chemical Society, 23, 349-354.