2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIấN CỨU
2.1.1 Đối tượng nghiờn cứu của mục tiờu 1: Xỏc định người lành mang
gen bệnh TSTTBS thể thiếu enzym 21-OH
130 thành viờn trong gia đỡnh bao gồm bố, mẹ, anh, chị, em ruột của bệnh nhõn TSTTBS thể thiếu enzym 21-OH đó được phỏt hiện mang đột biến trờn gen CYP21A2.
2.1.2 Đối tượng nghiờn cứu của mục tiờu 2: Chẩn đoỏn trước sinh bệnh TSTTBS thể thiếu enzym 21-OH TSTTBS thể thiếu enzym 21-OH
12 thai phụ mang gen dị hợp tửcú nguy cơ cao sinh con bị bệnh (cú con và chồng đó được xỏc định đột biến).
2.1.3 Tiờu chuẩn loại trừ
+ Cỏc thành viờn của gia đỡnh khụng đồng ý hợp tỏc tham gia xột nghiệm và chẩn đoỏn trước sinh.
+ Những bệnh nhõn và gia đỡnh đó được cụng bố trong những đề tài nghiờn cứu trước.
+ Những thai phụ được phỏt hiện là người lành mang gen nhưng đang bị cỏc bệnh về rối loạn đụng mỏu, viờm gan B, HIV ...và cỏc bệnh lý cú nguy cơ gõy sẩy thai khi làm thủ thuật chọc ối.
2.2 ĐỊA ĐIỂM NGHIấN CỨU
- Đề tài được tiến hành tại khoa Nội tiết-Chuyển húa-Di truyền và phũng xột nghiệm sinh húa, huyết học, khoa chẩn đoỏn hỡnh ảnh của Bệnh viện Nhi Trung ương là nơi chẩn đoỏn, điều trị và quản lý bệnh nhõn.
- Thủ thuật chọc dịch ối được thực hiện tại Trung tõm Chẩn đoỏn trước sinh, Bệnh viện Phụ sản Trung ương.
- Cỏc xột nghiệm sinh học phõn tử thực hiện tại Trung tõm Nghiờn cứu Gen và Protein, Trường Đại học Y Hà Nội.
2.3 THỜI GIAN NGHIấN CỨU
Thời gian 3 năm: từthỏng 9 năm 2011 đến 9 năm 2014.
2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
2.4.1. Thiết kế nghiờn cứu. Nghiờn cứu tiến cứu mụ tả, cắt ngang.
Hỡnh 2.1. Sơ đồ thiết kế nghiờn cứu 2.4.2. Mẫu nghiờn cứu
Sốlượng bệnh nhõn theo phương phỏp chọn mẫu tiện ớch.
2.4.3. Chỉ số nghiờn cứu
Nội dung nghiờn cứu cho mục tiờu 1: Xõy dựng phả hệ Phỏt hiện 130 người là thành viờn gia đỡnh (bố, mẹ, anh, chị, em ruột) 56 bệnh nhõn TSTTBS đó tỡm thấy đột biến gen CYP21A2 Tư vấn di truyền Thai phụcú nguy cơ sinh con
bị bệnh TSTTBS
Chẩn đoỏn trước sinh
-Lập phả hệgia đỡnh bệnh nhõn TSTTBS. -Tuổi của cỏc thành viờn gia đỡnh bệnh nhõn.
-Kết quả phõn tớch đột biến gen CYP21A2 cho bố, mẹ, anh, chị, em bệnh nhõn TSTTBS đó tỡm thấy đột biến.
Nội dung nghiờn cứu cho mục tiờu 2:
-Cỏc thụng tin về tỡnh trạng thai sản của cỏc thai phụ đang mang thai tuần thứ 6-16 tuần: tuổi của thai phụ, tuổi thai nhi (tớnh theo kỳ kinh cuối của thai phụ)
-Chọc ối cho cỏc thai phụ vào 15-16 tuần. -Phõn tớch gen CYP21A2 cho thai nhi.
2.5. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH NGHIấN CỨU CHO MỤC TIấU 1
Lựa chọn bệnh nhõn được chẩn đoỏn xỏc định bệnh TSTTBS thể thiếu hụt enzym 21-OH dựa theo đặc điểm lõm sàng và xột nghiệm sinh húa (phụ lục 1).
Bệnh nhõn đó được xỏc định cú đột biến gen CYP21A2.
2.5.1. Đặc điểm đối tượng nghiờn cứu
Bệnh nhõn bị TSTTBS: Tuổi. Giới: nam, nữ. Thể bệnh: mất muối, nam húa đơn thuần.
Khai thỏc xõy dựng phả hệ gia đỡnh cho từng bệnh nhõn theo ký hiệu qui ước quốc tế của hội di truyền người qui định (bảng phụ lục 3)[56]
Tất cả cỏc thành viờn trong gia đỡnh gồm: cha, mẹ, anh, chị, em ruột của bệnh nhõn được khỏm xột lõm sàng theo phương phỏp mụ tả, tư vấn để tiến hành xột nghiệm phỏt hiện đột biến gen CYP21A2.
Thành viờn gia đỡnh: Bố, mẹ, anh, chị, em ruột sau khi cú kết quảđột biến gen được chia làm ba nhúm:
- Khụng mang gen đột biến CYP21A2 tức là người lành hoàn toàn. -Cú mang một 1 gen đột biến CYP21A2 là người lành mang gen bệnh hay cũn gọi là dị hợp tử.
- Cú mang 2 alen đột biến khỏc nhau trờn gen CYP21A2 là người bệnh mang gen dị hợp tử kộp.
Lập phả hệcho gia đỡnh bệnh nhõn tối thiểu 3 thế hệ: ụng, bà, cha, mẹ và cỏc con theo ký hiệu đó được qui định.
Mỗi gia đỡnh nghiờn cứu cú một hồ sơ gồm cỏc thụng tin về bệnh nhõn: Tuổi của bệnh nhõn và cỏc thành viờn gia đỡnh, lõm sàng, chẩn đoỏn, kết quả đột biến gen và phả hệ của gia đỡnh, cỏc thụng tin về anh, chị, em ruột của bệnh nhõn.
2.5.2 Tiến hành xột nghiệm
2.5.2.1. Quy trỡnh thu thập mẫu nghiờn cứu và tỏch chiết DNA
Tất cả cỏc thành viờn của gia đỡnh bệnh nhõn lấy 2ml - 5ml mỏu ngoại biờn. Tỏch chiết DNA bằng Phenol/Chloroform theo phương phỏp thường quy của Trung tõm Nghiờn cứu Gen-Protein. Đo và kiểm tra nồng độ DNA bằng mỏy đo nồng độ Nano Drop 1000, chỉ những mẫu DNA cú độ tinh sạch 1,8-2 mới được sử dụng phỏt hiện đột biến gen.
2.5.2.2.Kỹ thuật PCR
Toàn bộ chiều dài gen CYP21A2 được khuếch đại bằng phản ứng PCR với cỏc cặp mồi đặc hiệu P1-P10; P3-P5; P6-P4.
Hỡnh 2.2. Vị trớ cỏc mồi cho phản ứng PCR khuyếch đại gen CYP21A2 [4].