- Thành phần phản ứng PCR
2 p.R356W/R356W p.R356W p.R356W
4.2.3. Bàn luận về cỏc trường hợp phả hệ gia đỡnh được minh họa
Sựra đời và ngày càng phỏt triển của sinh học phõn tửđó giỳp cho chẩn đoỏn bệnh TSTTBS thể thiếu 21-OH ngày càng chớnh xỏc và cú thể chẩn đoỏn sớm từ trong bào thai để giảm tỷ lệ mắc bệnh. Với hơn 100 dạng đột biến đó được cụng bố trờn thế giới và nhờ cỏc kỹ thuật hiện đại cỏc kết quả xột nghiệm phõn tớch gen nhanh chúng và cú độ chớnh xỏc cao.
Từ cỏc đột biến của bệnh nhõn, cỏc kỹ thuật viờn, dễ dàng tỡm thấy đột biến mà khụng cần phải phõn tớch cả đoạn gen (10 exon và intron) phỏt hiện người lành mang gen bệnh và cỏc thành viờn khỏc cú liờn quan huyết thống trong dũng họ.
Phõn tớch phả hệ của gia đỡnh số 01 ở hỡnh 3.1 và 3.2 cho thấy gia đỡnh cú 1 con trai bị bệnh TSTTBS thể mất muối được chẩn đoỏn khi 3 tuần tuổi với điển hỡnh của cơn suy thượng thận cấp. Bệnh nhõn bị đột biến ở intron 2 trờn gen CYP21A2 dạng đột biến đồng hợp tử IVS2-13A/C>G (c.656A/C>G), bố mẹ cú thể là người mang gen dị hợp tử và trong phả hệ khụng ai bị mắc bệnh giống bệnh nhõn. Sau khi phõn tớch gen cho bố, mẹ chỳng tụi nhận thấy bố bệnh nhõn cú mang gen dị hợp tử IVS2 -13A/C>G (c.656T/G>C) và mẹ cũng mang đột biến dị hợp tử tại vị trớ IVS2 -13A/C>G (c.656T/G>C). Từ kết quả xột nghiệm cho gia đỡnh bệnh nhõn số 01 chỳng tụi khẳng định bệnh nhõn đó nhận một alen bị đột biến tại intron 2 từ bố và 1 alen từ mẹ.
Nghiờn cứu của Violeta. A năm 2010 tại Macedona cho bệnh nhõn và gia đỡnh nhận thấy tỷ lệ phỏt hiện mang I2g ở thành viờn gia đỡnh là:12,9%. Nghiờn cứu nhận thấy dạng đột biến P30L cú tỷ lệ cao hơn: 20%, tỷ lệ khỏc nhau này trong cỏc nghiờn cứu cú liờn quan đến chủng tộc [9]. Đõy cũng là một dạng đột biến hay gặp trờn thế giới cũng như cỏc bỏo cỏo gần đõy của cỏc nước chõu Á như Nhật Bản, Trung Quốc.
Phõn tớch phả hệ của gia đỡnh số 27 hỡnh 3.3 và 3.4 cho thấy gia đỡnh cú con trai bị bệnh với kiểu hỡnh thể mất muối, mang gen đột biến điểm ở vị trớ p.R356W đồng hợp tử. Bố mẹ sau khi phõn tớch gen là người mang gen dị hợp tử, trong dũng họ khụng ai bị bệnh như bệnh nhõn. Đõy là dạng đột biến gõy thể lõm sàng mất muối nặng. Chăm súc cho bệnh nhõn điều trị bệnh suốt đời là một gỏnh nặng rất lớn về kinh tế và tõm lý cho cha mẹ bệnh nhõn, đặc biệt khi trẻ cũn nhỏ, cỏc nguy cơ xuất hiện cơn suy thượng thận cấp, nếu khụng được điều trị sớm và kịp thời cú thể gõy tử vong cho trẻ. Đột biến dạng này hay gặp trờn thế giới, tựy thuộc vào từng quốc gia mà tỷ lệ cú thay đổi. Đột biến dạng p.R356W cú tỷ lệ cao hơn ở cỏc nước chõu Á khỏc từ 9,5% - 19,2% ở người Trung Quốc, Nhật Bản, Ấn Độ, Malaysia [84]. Đột biến làm thay thế nucleotide 2110C>T làm cho bộ ba thứ 356 CGG mó húa cho Arginin bị chuyển thành TGG mó húa cho Tryptophan (R356W) gõy mất khả năng tổng hợp enzym, đột biến này đưa đến hậu quả làm nồng độ enzym giảm nặng, khụng đo được, gõy bệnh cảnh lõm sàng là thể mất muối nặng.
Phõn tớch phả hệ của gia đỡnh số 08 với hỡnh ảnh 3.5 và 3.6 cho thấy gia đỡnh cú hai con; con gỏi đầu cú kiểu hỡnh bỡnh thường, con trai sau khi sinh cú kiểu hỡnh bỡnh thường, khi trẻ 3 tuổi gia đỡnh thấy trẻ luụn lớn hơn bạn bố, kốm theo bộ phận sinh dục, dương vật phỏt triển ngày càng to hơn so với bạn bố cựng lứa tuổi. Gia đỡnh đưa trẻ đi khỏm và được chẩn đoỏn dậy thỡ sớm giả của bệnh TSTTBS. Sau khi phõn tớch gen của con trai cho kết quả mang dạng
đột biến đồng hợp tử p.I172N (c.999T>A) ở exon 4, với kiểu hỡnh thể nam húa đơn thuần. Kết quả phõn tớch gen của cỏc thành viờn gia đỡnh cho thấy bố mẹ bệnh nhõn cú mang gen đột biến p.I172N dạng dị hợp tử, chị gỏi (III.4) là người lành cú mang gen đột biến giống bố mẹ. Kết quả cho thấy người con trai thứ hai (II.2) nhận hai alen bị bệnh, 1 từ bố và 1 alen từ mẹ, nhưng chị gỏi chỉ nhận 1 alen bị bệnh từ bố hoặc mẹ nờn là người lành mang gen bệnh giống bố mẹ. Trong gia đỡnh và cỏc thành viờn khỏc khụng ai mắc bệnh giống bệnh nhõn. Dạng đột biến p.I172N hay gặp trờn thế giới với tỷ lệ khoảng 1,6- 19%. Đột biến I172N ở vị trớ 9994T>A làm giảm hoạt động emzym, nhưng cú thể đo được theo bỏo cỏo khoảng 0 - 2%, do vậy dạng đột biến này cú thể cú kiểu hỡnh mất muối nhẹ hoặc nam húa đơn thuần, tựy thuộc vào hoạt động của enzym trong mỗi cơ thể. Trong nghiờn cứu của chỳng tụi cú 3 gia đỡnh mang đột biến đồng hợp tử I172N, cú hai bệnh nhõn cú mang kiểu hỡnh thể NHĐT và 1 cú kiểu hỡnh thể mất muối, kết quả này của chỳng tụi phự hợp với nghiờn cứu Krone. N, năm 2000 ở Đức của 155 bệnh nhõn TSTTBS trong đú dạng đột biến p.I172N cú tỷ lệ: 19,7%, đột biến cho hai kiểu hỡnh nam húa đơn thuần hoặc mất muối [87].
Phõn tớch phả hệ của bệnh nhõn mó số 17 ở hỡnh 3.7 và 3.8 cho thấy, gia đỡnh cú 1 con gỏi bị bệnh TSTTBS thể mất muối và mang đột biến điểm ở vị trớ p.R426C. Trong dũng họ khụng ai mắc bệnh giống bệnh nhõn. Đõy là một dạng đột biến ớt gặp trờn thế giới, đột biến tại vị trớ c.1276 C>T, làm gõy biến đổi cấu trỳc của protein, sự xuất hiện của acid amin cystein ở vị trớ này sẽ dẫn đến enzym bị thay đổi nghiờm trọng và khụng đo được hoạt tớnh gõy thể mất muối trờn lõm sàng. Theo Yulia (2006) nghiờn cứu trờn bệnh nhõn ở Nga cho thấy đõy là 1/4 đột biến mới ở Nga, đõy là đột biến được tỡm thấy trờn một bệnh nhõn nữ cú biểu hiện kiểu hỡnh thểnam húa đơn thuần và phỡ đại õm vật typ IV theo Prader, được chẩn đoỏn khi 6 tuổi với biểu hiện nam húa và tuổi
xương tương đương với trẻ 13 tuổi. Sau khi phõn tớch gen bệnh nhõn cú mang đột biến dị hợp tử kộp I172N/R426C, bệnh nhõn nhận alen p.R426C từ mẹ và 1 alen p.I172N từ bố [90].
Phõn tớch phả hệgia đỡnh số 34 ở hỡnh 3.9 và 3.10, gia đỡnh sống ở Lào cai, một tỉnh miền nỳi phớa Bắc của Việt Nam, trong gia đỡnh cú một con gỏi bị bệnh TSTTBS thể mất muối nặng cú phỡ đại õm vật phõn loại theo typ 4 của Prader, do khụng được chẩn đoỏn bệnh đỳng và sớm, trẻ sau nhiều lần rối loạn điện giải bởi cơn suy thượng thận cấp đó để lại cho trẻ di chứng bại nóo. Khi trẻ 3 thỏng mới được khỏm và chẩn đoỏn bệnh TSTTBS tại Bệnh viện Nhi trung ương, và được phẫu thuật chỉnh hỡnh khi 5 thỏng tuổi. Hiện tại bệnh nhõn đó 8 tuổi, luụn trong tỡnh trạng tăng trương lực cơ và khụng tự sinh hoạt cỏ nhõn được. Bệnh nhõn được phõn tớch gen bằng kỹ thuật MLPA, kết quả cho thấy bị đột biến xúa đoạn tại exon 1 và exon 3, trong phả hệ thế hệ I và thứ II, khụng ai bị bệnh giống bệnh nhõn. Khi phõn tớch gen bằng kỹ thuật MLPA cho bố mẹ, cả bố và mẹđều mang gen đột biến xúa đoạn tại vị trớ exon 1 và exon 3. Gia đỡnh bệnh nhõn đó tham gia cõu lạc bộ TSTTBS tổ chức hàng năm ở Bệnh viện Nhi Trung ương, bảy năm sau người mẹ mới cú thai lần 2 và mong muốn được tham gia chẩn đoỏn trước sinh.
Phõn tớch phả hệ và kiểu gen gia đỡnh số 43 hỡnh 3.11 và 3.12, cú một con trai bị bệnh mang đột biến xúa đoạn lớn. Bố, mẹ là người dị hợp tử mang kiểu gen đột biến xúa đoạn lớn này. Đõy là dạng đột biến gõy thay đổi hoàn toàn cấu trỳc của gen CYP21A2 với hoạt độ enzym 21-OH khụng đo được dẫn đến thể lõm sàng mất muối nặng với cơn suy thượng thận cấp. Kiểu đột biến xúa đoạn hay gặp trờn thế giới với tỷ lệ khoảng 3,9-34% tựy thuộc vào từng quốc gia [1].
Một nghiờn cứu ở Brazil, phõn tớch gen cho 41 gia đỡnh bệnh TSTTBS thể thiếu enzym 21-OH nhận thấy tỷ lệ gặp dạng đột biến xúa đoạn là 8,1%
[71]. Trong đú đột biến mất đoạn 30kb được tỡm thấy với tỷ lệ thấp ở bệnh nhõn thể mất muối (4,5%) trong khi tỷ lệ gặp trung bỡnh trong cỏc bỏo cỏo khỏc là 20% ở thể mất muối ở chõu Âu và Mỹ. Tần số gặp đột biến xúa đoạn đó được bỏo cỏo là ở Nhật Bản: 11,8%, Trung Hoa – Đài Loan: 9,5%, Singapor: 3,9% [1],[84].
Một nghiờn cứu khỏc ở í ( 2011), đó sử dụng kỹ thuật giải trỡnh tự gen để phỏt hiện đột biến điểm và kỹ thuật MLPA với 152 bệnh nhõn nhận thấy tỷ lệđột biến xúa đoạn trung bỡnh là 25,6% [59].
Đột biến xúa đoạn lớn, dẫn đến mất toàn bộ chức năng enzym 21-OH dẫn đến hậu quả trờn lõm sàng với thể cổ điển mất muối nặng. Khi xột mối liờn quan giữa kiểu gen đột biến xúa đoạn với kiểu hỡnh trờn lõm sàng, chỳng tụi nhận thấy hoàn toàn phự hợp ở cỏc bệnh nhõn trong nghiờn cứu của chỳng tụi. Những năm gần đõy, ngày càng cú nhiều nghiờn cứu ứng dụng kỹ thuật MLPA xỏc định cỏc đột biến xúa đoạn và chuyển đoạn của gen CYP21A2. Kỹ thuật MLPA cho kết quảchớnh xỏc và nhanh, đặc biệt cú thể phỏt hiện cỏc đột biến ở người mang gen chớnh xỏc hơn thay thế cho kỹ thuật phõn tớch Southern blot.
Phõn tớch phả hệ của bệnh nhõn gia đỡnh số 25 với hỡnh minh họa 3.13 và 3.14 cho thấy, bố (II4) là người mang gen dị hợp tử dạng đột biến S125X, mẹ mang đột biến xúa đoạn tại exon 1 và exon 3. Trong dũng họ khụng ai mắc bệnh giống bệnh nhõn. Đõy là một đột biến mới ở exon 3 vị trớ nucleotide 752 C bị chuyển thành G. Dạng đột biến p.S125X ớt gặp, gõy thể bệnh mất muối trờn lõm sàng. Năm 2012, ở Việt Nam, bỏc sĩ Dũng và CS đó phõn tớch gen cho 81 bệnh nhõn TSTTBS tỷ lệ gặp dạng đột biến p.S125X là 1,2%, là một kiểu đột biến mới [80].
Phõn tớch phả hệ và kiểu gen của gia đỡnh số 24 ở hỡnh 3.15 và 3.16 cho thấy, gia đỡnh cú một con gỏi bị bệnh (III5) cú mang kiểu gen dị hợp tử kộp.
Sau khi phõn tớch gen cho bố mẹ, bệnh nhõn nhận 1 alen gõy bệnh mang đột biến p.I172N từ bố và mẹ mang đột biến p.Q318X. Đõy là cỏc dạng đột biến hay gặp ở Việt Nam và cỏc nước chõu Á. Nghiờn cứu năm 2011, Khan. A [86], phõn tớch gen cho 29 bệnh nhõn TSTTBS nhận thấy tỷ lệ gặp đột biến đồng hợp tử là 44%, và đột biến dị hợp tử kộp là 34%. Tỷ lệ người mang dị hợp tử kộp ở bệnh nhõn TSTTBS cao vỡ bệnh tuõn theo quy luật di truyền của Menden, nờn gen lặn gõy bệnh nằm trong cỏc dũng họ, bệnh chỉ biểu hiện khi cú mặt của 2 alen mang gen gõy bệnh dạng đồng hợp tử hoặc 2 alen cựng mang gen gõy bệnh ở hai vị trớ khỏc nhau. Trong kết quả nghiờn cứu của chỳng tụi, cú 15/56 gia đỡnh cú mang dị hợp tửkộp, trong đú hay gặp đột biến I2g kết hợp với một loại đột biến khỏc.
Phả hệ gia đỡnh số 49 ở hỡnh 3.17 và 3.18 cho thấy, gia đỡnh cú hai con gỏi đầu tử vong trong thỏng đầu sau khi sinh, khi 3 tuần tuổi, tại bệnh viện huyện. Cả hai bộ đều cú biểu hiện nụn sau sinh, da xạm và bất thường bộ phận sinh dục. 1 chị gỏi hiện đó 26 tuổi, cú gia đỡnh và 1 con 1 trai cú kiểu hỡnh bỡnh thường. Người con thứtư, con trai 2 tuổi, bị bệnh sau khi phõn tớch gen, bệnh nhõn cú mang 3 loại đột biến I2g, p.Q318X và p.R356W. Sau khi phõn tớch gen của bố và mẹ, cho thấy mẹ bệnh nhõn mang đột biến I2g và bố mang đột biến Q1318X. Đột biến gen p.Q318X và p.R356W là hai vị trớ đột biến cựng exon 6 gần nhau, trong quỏ trỡnh phõn chia hỡnh thành giao tử, do đột biến chuyển đoạn từ giả gen CYP21A1P chuyển đoạn sang gen CYP21A2 gõy dạng dị hợp tử kộp 3 gen đột biến cho bệnh nhõn. 2006 một nghiờn cứu ở Tõy Ban Nha, tỷ lệ lặp đoạn hay xảy ra ở exon 6 nhiều hơn ở exon 1 và 10, trong đú đột biến gõy lặp đoạn ở quần thể núi chung là 1,6%, của tỏc giả trong nghiờn cứu này gặp đột biến p.Q318X là 0,8% [24]. Một nghiờn cứu ở chõu Á, Chan. O. K. A tại Trung Quốc (2011) phõn tớch gen của 35 bệnh nhõn và gia đỡnh cho thấy tỷ lệ gặp đột biến p.Q318X và p.R356W khỏ cao 3/35 trường hợp trong đú cú 2 trường hợp cú đột biến lặp đoạn [84].