Mẫu thực vật thu đƣợc đem về giám định tên khoa học và phân tích trong phòng thí nghiệm.
3.2.2.1. Xác định tên khoa học của các mẫu thực vật
Chúng tôi sử dụng khóa phân loại hiện hành của các tác giả Nguyễn Tiến Bân và cộng sự (2001, 2003, 2005), [8], Lê Khả Kế (1969, 1975), [17], Phạm Hoàng Hộ (1993), [16] và một số tài liệu liên quan đến phân loại thực vật.
3.2.2.2. Xác định dạng sống
Chúng tôi mô tả dạng sống của từng loài theo phƣơng pháp của Hoàng Chung (2004), [11]
3.2.2.3. Xác định năng suất
Theo phƣơng pháp của Hoàng Chung (2008), [12]. Chúng tôi cắt phần ở trên mặt đất mà gia súc có thể sử dụng đƣợc tại mỗi điểm nghiên cứu. Mẫu mang về phòng thí nhiệm khoa Sinh – ĐHSP Thái Nguyên đƣợc phân thành 2 phần: phần tƣơi và phần chết. Phần tƣơi đƣợc phân chia theo các nhóm: Hòa thảo, xa thảo, cây Họ đậu, cây thuộc thảo, cây gỗ, cây bụi, dƣơng xỉ…sau đó sấy khô ở
phần chƣa hoàn toàn mục năm trên mặt đất thuộc phần chết chúng cũng đƣợc sấy khô và cân.
3.2.2.4. Đánh giá chất lượng cỏ
Chúng tôi lấy lá bánh tẻ của một số loài cỏ ƣu thế của từng thời điểm nghiên cứu, tiến hành phân tích các chỉ tiêu nƣớc, vật chất khô, protein, đƣờng, lipit, và chất xơ tại viện khoa học và sự sống – Đại học Thái Nguyên.
* Xác định hàm lượng nước trong cỏ
Ta hiểu hàm lƣợng nƣớc (%) là tỉ lệ phần trăm lƣợng nƣớc mất đi ( khi sấy
mẫu ở 1030 C đến khi khối lƣợng mẫu không đổi ) và lƣợng mẫu đem thử
(TCVN 43.26 - 86) [36].
Để xác định hàm lƣợng nƣớc chính xác, dùng đĩa Petri rửa sạch, ghi ký
hiệu, bỏ đĩa vào tủ sấy ở nhiệt độ 100 - 1050 C trong 2h. Sau đó lấy ra để nguội
trong bình hút ẩm rồi cân trọng lƣợng lần 1. Tiếp tục sấy và cân cho đến khi trọng lƣợng không đổi, ghi lại trọng lƣợng từng đĩa đó vào sổ (cho phép sai số giữa các lần cân là 0,001g ).
Sau khi chuẩn bị xong đĩa, chúng tôi tiến hành cân mẫu vào đĩa khi đã biết
trọng lƣợng bì sau đó cho vào tủ sấy 4 – 5 h ở nhiệt độ 100 - 1050 C. Lấy ra để
nguội trong bình hút ẩm rồi cân trọng lƣợng lần 1, tiếp tục sấy thêm 2 h nữa, lấy ra để nguội trong bình hút ẩm rồi cân trọng lƣợng lần 2. Nếu thấy trọng lƣợng không đổi hoặc ghi lại sai số là 0,003 coi nhƣ là đƣợc. Sau đó ghi lại kết quả và tính theo công thức:
Trong đó:
X: Hàm lƣợng nƣớc (%);
X = A B
W x 100
B: Trọng lƣợng bình + trọng lƣợng mẫu sau khi sấy (g); W: Trọng lƣợng mẫu ban đầu (g);
* Phương pháp phân tích hàm lượng chất khô:
Chất khô (%) =100% - Hàm lƣợng nƣớc (%).
* Phương pháp phân tích hàm lượng Protein thô:
Hàm lƣợng protein thô đƣợc xác định theo phƣơng pháp Lowry 8,10; Nguyên tắc:
Protein tác dụng với thuốc thử Folin sẽ tạo thành sản phẩm màu xanh. Đây là sản phẩm khử của Photphomoliden – photpho - Wotframat bởi phức chất đồng của Protein. Dùng máy so màu để xác định cƣờng độ mầu trong các màu và dựa vào đƣờng chuẩn để tính hàm lƣợng Protein của mẫu nghiên cứu.
Hóa chất: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Dung dịch chiết Protein: Tris HCl hoặc dung dịch đệm photphat citrat. - Protein chuẩn thƣờng dùng tinh chế Albumin huyết thanh bò (BSA- Bovineserum Albumin).
- chuẩn bị dung dịch Protein chuẩn với nồng độ 10, 20, 30, 40,80,100, ug/ml pha trong NaCl 0,9 %.
- Dung dịch A: 5,4 g Na2CO3 2% trong 100 ml NaOH 0,1 M;
- Dung dịch B: 0,75 g CuSO45 H2O 0,5 % pha trong 100 ml nƣớc cất.
- Dung dịch C: 1,3 g Tactorat Na, K, 1 % (C4H4O6KNa, 4H2O) pha trong
100ml nƣớc cất.
- Dung dịch D: 48 phần dung dịch A + 1 phần dung dịch B + 1 phần dung dịch C.
- Dung dịch Folin pha loãng 2 lần. Chú ý: cách pha loãng dung dịch Folin
Tiến hành:
Bƣớc 1: Chuẩn bị mẫu: Mẫu đƣợc sấy khô tuyệt đối (105oC). Nghiền nhỏ
dạng bột mịn.
Bƣớc 2: Chiết Protein bằng dung dịch Trí HCl hoặc bằng đệm photphat
citrat + NaCl + H2O.
- Cân 0,05 g bột mẫu cho vào tube + 1,5 ml dung dịch chiết.
- Đem để tủ lạnh (ngăn 4oC ) trong 24 giờ.
- Mang mẫu ly tâm bằng máy ly tâm lạnh 12000 vòng /phút trong 30 phút.
- Lấy phần dịch phía trên cho sang ống nhiệm bằng thủy tinh.
Các bƣớc trên đƣợc lập lại 3 lần với mỗi dung dịch chiết, dịch chiết thu đƣợc cho vào cùng 1 ống nhiệm. Chuẩn lƣợng dịch chiết Protein lên 5 hoặc 10 ml.
Bƣớc 3: Chuẩn bị ống đem đo 1,25 ml dung dịch D + 0,75ml H2O + 0,25
ml dịch chiết Protein + 0,25ml Folin. Để khoảng 45 phút sau đem đo trên máy quang phổ (Trƣờng ĐH sƣ phạm Thái Nguyên).
Bƣớc 4: Khởi động máy quang phổ và đặt bƣớc sóng 750 mm vào đo Blank để điều chỉnh độ hấp thụ về 0 với Cuvet chứa NaCl 0,9 %.
Bƣớc 5: Đánh dấu các ống nhiệm từ 1-6 tƣơng ứng với các nồng độ Protein chuẩn từ 10 -100 ug/ml. Sau đó hút vào mỗi ống nhiệm 100 ml dung dịch Protein chuẩn, 1 ml dung dịch D lắc đều để ở nhiệt độ phòng 10 phút. Tiếp tục cho thêm vào 100 ul thuốc thử Frolin, lắc nhẹ và để ở nhiệt độ phòng 15 phút. Xác định cƣờng độ màu trên máy so mẫu. Từ các số liệu thu đƣợc tiến hành xây dựng đồ thị chuẩn.
Bƣớc 6: Với các mẫu cần xác định đƣợc lặp lại bƣớc 2 để xác định cƣờng độ mầu. Từ cƣờng độ mầu thu đƣợc xác định nồng độ của Protein trong mẫu nhờ đồ thị chuẩn.
Kết quả đƣợc tính theo công thức:
X = (200M ) 50 x 100
Trong đó : X ( %): Là hàm lƣợng Protein của mẫu. M (mg): Là lƣợng Protein trong đó đem đo.
* Phương pháp phân tích hàm lượng chất xơ:
Chất xơ đƣợc xác định theo phƣơng pháp Hennerberg –Stohmann (37). Nguyên tắc: Đây là phƣơng pháp thông dụng nhất đƣợc sử dụng ở nhiều nƣớc nhƣ các phƣơng pháp chuẩn. Chất xơ đƣợc xác định qua hai quá trình thủy phân axit và bazo trong các điều kiện quy định nghiêm ngặt.
Nội dung:
Dùng dung dịch axit HCl và dung dịch kiềm thủy phân và tách các chất hòa tan trong axit và kiềm, cuối cùng dùng hỗn hợp ete cồn để hòa tan nốt các chất hữu cơ hòa tan trong dung môi hữu cơ. Phần còn lại đƣợc gọi là xơ thô. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Dụng cụ và hóa chất:
Việc phân tích chất xơ đƣợc tiến hành trên thiết bị phân tích sơ Fibertec System (Trƣờng ĐH Nông –Lâm, Thái Nguyên ). Gồm có:
- Bình tam giác. - Bông Amian. - Chén lọc bằng sứ. - Đũa thủy tinh.
- Máy hút chân không .
- Bình hút ẩm .
- Cân phân tích với độ chính xác cao. - Cốc đốt dung tích 500 - 600 ml. - Lo nung điều chỉnh đƣợc nhiệt độ. - Phễu lọc Đorangdi.
Hóa chất:
- Dung dịch Axit sunphuaric 1,25 %
- Dung dịch KOH 1,25 % (hòa tan 25 g KOH vào 1 lít nƣớc cất ). - Etanol
- Ete petrol.
Các bƣớc tiến hành
Cân mẫu đã đƣợc chuẩn bị sẵn (ở trạng thái khô không khí, nghiền nhỏ) trên cân phân tích có độ chính xác 0,0001 gam, cân khoảng 2 - 3 gam .
Chuẩn bị chén lọc: Chén lọc đƣợc rửa sạch, sấy khô, cân khối lƣợng chén trên cân phân tích với độ chính xác 0,0001 gam. Giấy lọc amian cũng phải đƣợc xử lý đun sôi trong dung dịch KOH 1,25% trong vòng 30 phút. Sau đó rửa sạch
qua ete, sấy khô rồi nung ở nhiệt độ 500 - 600oC trong vòng 2 giờ, để nguội
trong bình hút ẩm rồi cân trên cân phân tích có độ chính xác 0,0001 gam (cân khoảng 2 gam Amian ). Cho giấy lọc Amian vào đầy chén.
Cho mẫu vào cốc đun có dung tích khoảng 500 - 600 ml. Rót vào cốc 200 ml dung dịch Axit sunphuaric 1,25 %, đánh dấu vạch mức. Đặt cốc lên bếp điện
đun ở nhiệt độ 80 - 90o
C. Thời gian đun sôi cần phải nhanh trong khoảng 2 phút sau đó giữ trong khoảng 30 phút nữa. Nếu nhƣ thể tích của cốc bị hụt đo trong quá trình đun thì bổ sung thêm bằng nƣớc cất đã đun sôi.
Sau đó lấy cốc ra khỏi bếp để lắng và lọc qua giấy lọc bằng phễu Đorang đi để tách phần còn lại và dịch axit. Nếu lƣợng xơ trên 80 % thì có thể dùng phễu thủy tinh có bịt vải nilon có lỗ thƣa không quá 1 mm để lọc hút bằng máy hút chân không. Sau khi hút xong, dùng bình tia đựng nƣớc cất đã đun nóng rửa cặn bám ở vải hoặc giấy lọc, thành cốc xuống dung dịch, thêm nƣớc cất nóng vào cốc cho đến vạch mức và lặp lại quá trình trên một lần nữa cho đến khi đạt độ trung tính ( thử bằng giấy quỳ ).
Sau khi thủy phân bằng axit, chuyển sang công đoạn 2 (thủy phân bằng bazo): Chuyển toàn bộ phần còn lại vào cốc đun, cho vào cốc 50 ml dung dịch KOH 16 %, thế nƣớc cất trong vạch là 200 ml. Đun sôi nhanh (trong vòng 2
phút) và giữ nhiệt độ khoảng 80 - 90oC trong vòng 30 phút kể từ khi bắt đầu sôi.
Sau khi thủy phân với bazo, rửa bằng nƣớc cất cho tới khi hết phản ứng với bazo, chuyển phần còn lại vào chén lọc đã chuẩn bị sẵn, dùng nƣớc cất nóng rửa cặn chén trong 2 lần, sau đó dùng cồn và ete rửa tiếp (3 lần rửa, mỗi lần 5 ml).
Sấy chén lọc có chứa chất xơ ở 105oC trong vòng 4 giờ. Để nguội trong
bình hút ẩm và cân khối lƣợng, lặp lại quá trình trên cho đến khi có khối lƣợng không đổi.
Sau đó cho chén sứ có chứa chất xơ đã sấy khô vào lò nung và nung ở
550oC trong vòng 2 giờ, để nguội trong bình hút ẩm và cân khối lƣợng trên cân
phân tích có độ chính xác cao.
Tính toán kết quả: Hàm lƣợng xơ thô tính theo % theo công thức sau:
Trong đó: X = (M 2 M 3)
M1 x 100 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
X: Hàm lƣợng xơ thô (%).
M2: Khối lƣợng chất xơ sau khi sấy khô.
M3: Khối lƣợng tro của chất xơ sau khi nung
* Phương pháp xác định hàm lượng đường:
- Hàm lƣợng đƣờng tan đƣợc xác định theo phƣơng pháp vi phân tích đƣợc mô tả trong tài liệu của Phạm Thị Trân Châu và Cs [3].
- Mẫu nghiền mịn, sấy khô, cân khối lƣợng 0,05 gam, mẫu cho vào ống
eppendort, thêm 1,5 ml nƣớc cất, lắc đều trong 10 phút. Để 40C trong 24 giờ. Sau
đó li tâm lạnh ở 40
C với vận tốc 12 000 vòng /phút trong thời gian 30 phút. Thu lấy dịch trong chứa đƣờng tan, quá trình đó lặp lại 3 lần.
- Hàm lƣợng đƣờng tính theo công thức:
X% = A B HSPL
M x 100
X: Hàm lƣợng đƣờng tan có trong mẫu (%). A: Nồng độ đo đƣợc trên máy ( mg/ml ) B: Số ml dịch chiết.
HSPL: Hệ số pha loãng.
M: Khối lƣợng mẫu khô tuyệt đối ( mg).
3.2.2.5. Đối với mẫu đất
Ở mỗi điểm nghiên cứu mẫu đất đƣợc lấy theo tầng ở độ sâu; 0 - 10 cm, 10 - 20 cm, 20 - 30 cm, sau đó các mẫu đất ở cùng tầng của mô hình đƣợc trộn chung với nhau và đem phân tích theo tầng tại phòng phân tích đất – Viện Khoa Học và Sự Sống – ĐHTN bằng các phƣơng pháp sau:
- Xác định độ ẩm: Cân 10 gam mẫu đất trên cân độ ẩm kett, bật đèn hồng ngoại, xấy mẫu đến trọng lƣợng không đổi, đọc số đo độ ẩm trên cân.
- Xác định độ PH: Cân 30 gam mẫu đất cho vào cốc nhựa 120 ml, thêm 60 ml nƣớc cất ,đậy nắp cốc lại, đƣa lên mấy lắc trong 10 phút, sau đó đun bằng máy đo PH (PACH của Mỹ ).
- Xác định hàm lƣợng mùn (%) theo phƣơng pháp tiu rin: Cân 0,1 gam
đất đã qua sấy 0,25 mm cho vào bình tam giác 100ml + 10 ml K2Cr2O7 (0,4 N)
lắc nhẹ. Đặt lên bếp cách cát đun sôi nhẹ trong 5 phút ở nhiệt độ 1700C - 1800C,
nhấc xuống đệ nguội. Cho vào 1 ml H3PO4 và 8 giọt chỉ thị màu
Phenyiantranyn. Dùng muối Mỏ chuẩn độ lƣợng Kalybicreemat thừa đén lúc dung dịch biến đổi sang màu xanh, tính kết quả.
- Xác định hàm lƣợng đạm tổng số (N%) theo phƣơng pháp KenĐan cân 1
g đất + 5ml H2O để ƣớt mẫu + 5 ml H2SO4 đặc, đun trên bếp điện cho thoát khói
trắng xanh nhấc xuống để nguội cho vào 3 giọt HClO4 và đun cho trắng màu.
Đem mẫu đã đƣợc công phá chƣng cất bằng KenĐa, thời gian từ 20 – 25 phút thu đƣợc dung dịch màu tím đỏ, sau đó chuẩn bằng NaOH 0,02 N từ tím đỏ sang màu lục tính kết quả.
- Xác định hàm lƣợng lân tổng số (P2O5 %): Hút 5 ml dung tích mẫu sau
khi công phá, chỉnh đến PH = 7 + dung dịch NaOH 10 %, sau đó thêm 10 ml (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
H2SO4 (5N) thêm 1,25 ml dung dịch Amoni molipdat 20 % và 3 ml dung dịch
axit ascorbic 1 M đun cách thủy trên bếp khi cƣờng độ màu lớn nhất, để nguội đến nhiệt độ phòng, định mức đến 50 ml, đem so màu trên máy DERLL/2000, số
đọc đƣợc là % P2O5.
- Xác định hàm lƣợng Kali tổng số (% K2O) theo phƣơng pháp quang phổ
phát xạ. Nguyên tắc của phƣơng pháp này là thu bức xạ nguyên tử Kali phát ra dƣới tác dụng ngon lửa hồ quang. Khi bức xạ này đi qua máy quang phổ nhiễm xạ thu đƣợc phổ bức xạ. Cƣờng độ vạch phổ tỉ lệ với nồng độ nguyên tố Kali trong mẫu.
Đo cƣờng độ vạch phổ ta tính đƣợc nồng độ nguyên tố. Phép đo thực hiện trên máy quang phổ loại DFS 8 - 3. Độ nhạy vạch K là 0,01%.
Chƣơng 4
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU