Yếu tố đầu vào
Mức biến mã
-1 0 1
Nhiệt độ chiết (0C) X1 Thời gian chiết (phút) X2 Tỷ lệ dung môi : nguyên liệu (v/w) X3 60 30 20 80 105 35 100 180 50
Bảng 2.2. Thiết kế thí nghiệm theo biến mã sử dụng mơ hình Box-Behnken TN Nhiệt độ (oC) X1 Thời gian (phút) X2 Tỷ lệ DM/NL (v/w) X3 1 60 30 35 2 100 30 35 3 60 180 35 4 100 180 35 5 60 105 20 6 100 105 20 7 60 105 50 8 100 105 50 9 80 30 20 10 80 180 20 11 80 30 50 12 80 180 50 13 80 105 35 14 80 105 35 15 80 105 35
Quy trình chiết tách:
Thí nghiệm cơ sở được tiến hành khi chiết 15g bột rong trong dung dịch chiết là 450 ml nước với tỷ lệ dung môi: nguyên liệu (mL/g) là 30:1, chiết tại nhiệt độ khác nhau (600C, 800C, 1000C), mỗi một điều kiện nhiệt độ lại chiết tại các thời gian chiết khác nhau (30’, 105’, 180’). Sau khi chiết xong, lọc lấy dung dịch chiết, tủa với cồn tuyệt đối (Vcồn : Vdung dịch chiết = 4 : 1). Gạn lọc rồi ly tâm lấy tủa, rửa tủa nhiều lần bằng cồn 850, 960. Đông khô thu được sulfate polysaccharide [87].
Ở các thí nghiệm tiếp theo, khảo sát lần lượt ảnh hưởng của từng yếu tố chiết đến quá trình chiết polysaccharide bằng cách thay đổi giá trị yếu tố đó trong khi giữ 3 yếu tố còn lại ở giá trị cơ sở. Mỗi thí nghiệm được thực hiện 3 lần, kết quả hiệu suất chiết và hàm lượng polysaccharide là giá trị trung bình 3 lần đo.
Chiết sulfate polysaccharide tự nhiên (SP) nóng và lạnh theo quy trình
của Craigie and Leigh (1978) [42] như sau: Rong sau khi đã loại chất màu và chất béo bằng ethanol được chiết với dung dịch NaCl 0,05 M tại nhiệt độ 22oC trong thời gian 24 giờ (chiết lạnh), bã rong được chiết nóng với dung dịch NaHCO3 0,5M tại nhiệt độ 90oC, trong 2 giờ. Dung dịch chiết nóng và chiết lạnh sau khi được lọc đem tủa với cetylpyridinium chloride (CPC) và thực hiện phản ứng trao đổi với ion Na+ trong môi trường NaCl/ethanol 80%, thu được tủa SP. Hịa tan tủa bằng nước cất và đem đơng khô thu được SP dạng bột, đem cân và tính hiệu suất. Mẫu sulfate polysaccharide chiết lạnh và chiết nóng được ký hiệu là TN1 và TN2 tương ứng.
Chiết sulfate polysaccharide bằng xử lý kiềm (OH-)[42]: Rong được xử
lý với NaOH 0,5 Mol/l trong 12 giờ tại nhiệt độ phịng (chiết lạnh), chiết nóng ở nhiệt độ 800 C trong 3 giờ và rửa vòi nước trong vịng 30 phút. Hỗn hợp chiết nóng, lạnh đem lọc và ly tâm loại bỏ phần cặn nổi trên. Dung dịch lọc được chỉnh về pH=3 bằng dung dịch HCl, ly tâm loại tủa, dung dịch được tủa bằng ancol 80% để qua đêm, rửa tủa 3 lần bằng ancol, sấy tủa thu được SP. Mẫu sulfate polysaccharide chiết kiềm lạnh và nóng được ký hiệu là TN3 và TN4.
Quy trình chiết tách bằng các sơ đồ sau:
b) Chiết sulfate polysaccharide tự nhiên(nóng, lạnh)
B. gelatinus
B. gelatinus không màu
Bã rong Dung dịch chiết 1 Dung dịch chiết 2 Tủa cetylpyridinium chloride (CPC) Xử lý chất màu và chất béo bằng ethanol Chiết lạnh (NaCl 0,05 M, 22oC, 24 giờ) Chiết nóng (NaHCO3 0,5 M, 90oC, 2 giờ) Dung dịch Lọc Lọc
Tủa cetylpyridinium chloride (CPC) Trao đổi Na+/ NaCl/ethanol 80% Trao đổi Na+/ NaCl/ethanol 80%
Thu tủa SP Thu tủa SP
Hòa tan tủa bằng nước cất, đông khô Hịa tan tủa bằng nước cất, đơng khô Sulfate polysaccharide chiết lạnh
(TN1)
Sulfate polysaccharide chiết nóng (TN2)
c) Chiết sulfate polysaccharide bằng xử lý kiềm
Hình 2.4. Quy trình chiết tách (a, b, c).
2.2.1.2.Các phương pháp phân tích
a) Xác định độ ẩm của rong [88]: Độ ẩm được phân tích bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi và cân khối lượng.
Nguyên tắc của phương pháp xác định độ ẩm: dùng nhiệt để làm bay hơi nước có trong mẫu. Cân khối lượng rong trước và sau khi sấy khô. Từ chênh lệch khối lượng mẫu trước và sau khi sấy, tính được độ ẩm của mẫu.
B. gelatinus
Xử lý
NaOH 0,5 M, 12 giờ, nhiệt độ phòng
Dịch lọc chỉnh về pH=3 bằng dung dịch HCl
Dung dịch
Tủa bằng ancol 80 % để qua đêm
Rửa tủa 3 lần bằng ancol
Sulfate polysaccharide chiết kiềm lạnh (TN3)
Lọc, ly tâm, bỏ cặn
Ly tâm, loại tủa
Độ ẩm của mẫu được tính theo cơng thức:
Độ ẩm (%) = *100%
b) Xác định hàm lượng protein: Protein được xác định theo phương pháp Lowry [89].
* Nguyên tắc
Dựa trên cơ sở protein có khả năng phản ứng với thuốc thử Folin tạo phức chất có màu xanh da trời. Cường độ màu tỷ lệ thuận với nồng độ protein trong một phạm vi nhất định.
Đo cường độ màu bằng thiết bị đo màu quang điện ở bước sóng 750nm. Dựa vào đồ thị protein chuẩn (BSA) có thể xác định được hàm lượng protein ở nồng độ vài chục µg.
c) Xác định hàm lượng Lipid: Lipid được xác định theo phương pháp Soxhlet [90] và phương pháp Folch [91].
Nguyên tắc: Lipid thô được chiết xuất trong máy chiết Soxhlet (Soxtec System HT6, Tecator, Hoganas, Thụy Điển) với chloroform - methanol (2: 1, v / v) và sau đó được tinh chế theo phương pháp của Folch et al. (1957). Dịch chiết lipid tinh khiết được làm bay hơi đến khô trong thiết bị bay hơi nitơ Rapidrap (Labconco, MO).
d) Xác định hàm lượng tro: Hàm lượng khoáng xác định bằng phương pháp nung hóa tro 650oC [88].
Chén nung được rửa sạch và nung ở nhiệt độ 650oC đến khối lượng khơng đổi, sau đó cân mẫu rong 1,0 g cho vào cốc nung, đem đun trên bếp điện đến khi hóa than đen. Sau khi hóa than ta chuyển vào lị nung ở nhiệt độ 650oC để hóa tro hồn tồn (chuyển màu trắng), lặp lại ít nhất 2 lần và cân đến khối lượng khơng đổi.
Tính ra tỷ lệ % của tro chứa trong rong biển theo công thức sau: X (%) = (A - B).100 / m
B: Khối lượng chén nung (g)
m: Số gam rong biển dùng để thí nghiệm.
2.2.1.3. Xác định sulfate theo phương pháp BaCl2 của Dodgson KS [92] [92]
Hàm lượng sulfate được xác định bằng phương pháp đo độ đục với BaCl2/gelatin. Cân khoảng 5 mg mẫu carrageenan trong một lọ thủy tinh có nút vặn, dung tích 5ml, thêm 2 ml HCl 1N, đem thủy phân ở nhiệt độ 100oC, thời gian 6 giờ. Lấy 10 µl dung dịch mẫu sau thủy phân, thêm vào 100 µl TCA (Triclorua acetic acid) và 100µl hỗn hợp (0,5% gelatin và 0,5% BaCl2), lắc đều và đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 360 nm.
DS(%) = DS: hàm lượng sulfate (%);
mBaSO4: khối lượng của BaSO4 (g); m: khối lượng mẫu thử nghiệm (g).
2.2.1.4. Xác định carbohydrate theo phương pháp phương pháp Phenol-Sulfuric acid của Dubois [93] Phenol-Sulfuric acid của Dubois [93]
Hàm lượng tổng carbohydrate được xác định bằng phương pháp phenol-Sulfuric acid. Chuẩn bị dung dịch mẫu có nồng độ carbohydrate thích hợp, lấy 200µl dung dịch mẫu thêm vào 200µl thuốc thử phenol 5% lắc đều đến khi dung dịch trở nên trong suốt thêm tiếp 1ml sulfuric acid đậm đặc lắc đều rồi đem đun cách thủy trong thời gian 5 phút lấy ra để nguội, đo độ hấp thụ quang ở bước sóng λ = 490 nm. Dung dịch chuẩn sử dụng glucose hoặc galactose.
2.2.1.5. Xác định 3,6-anhydrogalactose theo phương pháp Yaphe và CS [94] [94]
Xác định hàm lượng 3,6-anhydro-L-galactopyranose bằng phương pháp Resorcinol, dùng fructose làm chất chuẩn: Lấy 1 mL dung dịch cần xác định có nồng độ từ 0 đến 0,25 µmol/mL. Thêm 10 mL dung dịch thuốc thử
Resorcinol – acetal ở nhiệt độ 20oC, lắc trong 4 phút. Sau đó đun nóng đến 80oC trong 10 phút, làm lạnh bằng nước đá trong 1,5 phút, đo trên máy UV- VIS ở bước sóng 555 nm. Mẫu đo tránh tiếp xúc với ánh sáng mạnh.
2.2.2. Các phương pháp vật lý
2.2.2.1. Phương pháp phổ hồng ngoại (IR)
Phổ hồng ngoại được đo trên máy FT-IR Affinity-1S SHIMADZU tại Bộ mơn Hóa vơ cơ – Khoa Hóa học – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội.
2.2.2.2. Phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Phổ NMR của mẫu nghiên cứu được đo ở nhiệt độ 70ºC, với dung môi D2O, trên máy Bruker AVANCE 500MHz tại Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, sử dụng D2O làm dung môi, DSS (4,4- dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic acid) làm chất chuẩn nội. Với chế độ đo khử tín hiệu của nước.
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. CHIẾT SULFATE POLYSACCHARIDE TỪ LOÀI RONG
BETAPHYCUS GELATINUS
3.1.1. Kết quả xác định một số thành phần của rong nguyên liệu
Để đánh giá sơ bộ chất lượng của rong Betaphycus gelatinus và định
hướng quy trình tách chiết, chúng tơi tiến hành phân tích một số thành phần hóa học của nguyên liệu này và kết quả phân tích được chỉ ra trên bảng 3.1.