Nồng độ K2SO4 (µg/ml) Oy 360nm Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình 100 0,030 0,031 0,031 0,031 ± 0,001 250 0,095 0,097 0,096 0,096 ± 0,001 500 0,190 0,195 0,199 0,195 ± 0,005 750 0,274 0,275 0,265 0,271 ± 0,006 1000 0,365 0,363 0,366 0,365 ± 0,002 1250 0,445 0,444 0,469 0,453 ± 0,014 1500 0,519 0,512 0,521 0,517 ± 0,005
Phương trình: y = 0,0004x+0,0059, tuyến tính trong khoảng
0-1500µg/ml Với giá trị R2 = 0,9973 1 Có thể áp dụng Trong đó: x: nồng độ (µg/mL) và y: mật độ quang.
3.2.2. Kết quả phân tích thành phần hóa học
Bảng 3.8. Thành phần hóa học chính của polysaccharide chiết từ rong
Betaphycus gelatinus
STT THÀNH PHẦN TỶ LỆ PHẦN TRĂM
01 Sulfate (w/w của trọng lượng mẫu khô) 18,70
02 Galactose (gal) 53,27
03 3,6 - anhydrogalactose (angal) 28,03
Bảng 3.9. Hiệu suất và thành phần hóa học của sulfate polysaccharide chiết
từ loài rong Betaphycus gelatinus
Mẫu Hiệu suất (% rong khơ)
Thành phần hóa học (%) Tỷ lệ DA:G 3,6 - anhydrogalactose Galactose Sulfate
TN1 4,20 17,30 55,36 27,34 1:3,20
TN2 49,50 21,00 58,80 20,20 1:2,80
TN3 8,70 36,20 44,50 19,30 1:1,25
TN4 32,00 37,60 45,36 17,04 1:1,21
Hiệu suất chiết và thành phần hóa học của sulfate polysaccharide thu được từ các điều kiện chiết khác nhau được dẫn ra trên bảng 3.9. Kết quả bảng 3.9 cho thấy rằng sulfate polysaccharide chiết tự nhiên tại 02 điều kiện chiết khác nhau là chiết lạnh (220C) và chiết nóng 900C có hiệu suất chiết tổng là 53,70%. Trong khi tại điều kiện chiết xử lý kiềm có hiệu suất chiết
tổng là 40,70 %. Xử lý kiềm là giảm hiệu suất chiết 13,00 %, điều này có thể giải thích là do điều kiện nhiệt độ cao của dung dịch kiềm làm phá hủy polysaccharide, gây ra gãy mạch polysaccharide và những phân tử có khối lượng nhỏ khơng tủa với cồn. Hiệu suất chiết sulfate polysaccharide từ rong
Betaphycus gelatinus là 53,70 % cao hơn hiệu suất của một số loài rong khác
như Kappaphycus alvarezii, Eucheuma denticulatum, Hypnea musciformis
(30-40 %) [96, 97]. Kết quả này có thể cho rằng rong Betaphycus gelatinus là nguyên liệu đầy tiềm năng cho sản xuất polysaccharide.
Kết quả phân tích thành phần monosacaride dẫn ra ở bảng 3.8 và 3.9 cho thấy rằng thành phần monosacaride chính của polysaccharide là galactose, 3,6-anhydrogalactose và sulfate. Với hàm lượng sulfate cao chứng tỏ rằng sulfate sự có mặt gốc 3,6 – anhydrogalactopyranosyl, chứng tỏ mẫu chiết là carrageenan họ β- có khả năng tạo gel loại (ι-carrageenan hay κ- carrageenan).
Việc xử lý kiềm nhằm thực hiện phản ứng đóng vịng chuyển hóa các gốc D-galactose-6-sulfate (DG6S) kém bền thành 3,6 - anhydrogalactose với mục đích làm tăng chất lượng carrageenan, thông qua làm tăng hàm lượng 3,6- anhydrogalactose và giảm hàm lượng sulfate. Trong nghiên cứu này, chúng tôi cũng thu được kết quả tương tự. Khi xử lý kiềm hàm lượng 3,6- anhydrogalactose tăng lên 15,0 % và hàm lượng sulfate giảm xuống 9,0% , tỷ lệ Angal:Gal thay đổi từ 1:1,32 đến 1:1,08 và tỷ lệ 1:1,08 rất gần với tỷ lệ của sulfate polysaccharide họ -carrageenan (1:1.0). Sự thay đổi đáng kể của hàm lượng Angal trong các mẫu chiết xử lý kiềm xác nhận sự có mặt hợp chất chỉ thị (precursor) là μ-carrageenan và ι - carrageenan. Kết quả này tương tự với công bố của nhóm tác giả [98]. Như vậy, có thể cho rằng sulfate polysaccharide chiết từ rong Betaphycus gelatinus là hỗn hợp carrageenan
bao gồm -carrageenan, β-carrageenan và μ hoặc γ - carrageenan precursor. Để các nhận kết quả trên, chúng tơi tiến hành phân tích cấu trúc bằng phương pháp phổ hồng ngoại (IR) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR).
3.3. PHÂN TÍCH ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC BẰNG PHƯƠNG PHÁP VẬT LÝ LÝ
3.3.1. Phân tích cấu trúc bằng phương pháp phổ hồng ngoại
Phổ hồng ngoại là phương pháp phân tích nhanh và thuận tiện để nghiên cứu cấu trúc phân tử thông qua việc sắp xếp các vạch phổ dao động tương ứng với nhóm nguyên tử nhất định trong phân tử. Trong phân tích cấu trúc của polysaccharide, phương pháp phổ IR cho biết các thơng tin về vị trí nhóm sulfate tồn tại trong phân tử carrageenan, từ đó cho biết về đặc trưng cấu trúc của chúng. Theo các tài liệu tham khảo, các dao động hấp thụ ở vùng số sóng 820-828 cm-1 đặc trưng cho liên kết C-O-S ở vị trí equatorial C2 hoặc/và C3, vùng 840-848 cm-1 đặc trưng cho liên kết C-O-S ở vị trí axial C4, vùng 1240-1272 cm-1 đặc trưng cho dao động hóa trị của S=O.
Phổ hồng ngoại của các mẫu được trình bày trên hình 3.7; hình 3.8; hình 3.9; hình 3.10 và phân tích phổ được dẫn ra trên bảng 3.10.
Phân tích phổ hồng ngoại của tất cả các mẫu sulfate polysaccharide cho thấy các dải hấp thụ chính tương tự với phổ hồng ngoại của polysaccharide. Chúng bao gồm dải hấp thụ với cường độ mạnh 3418 (3420) cm-1 thuộc về dao động hóa trị của liên kết OH, vân phổ trong vùng 2926 (2923) cm-1 và vân phổ trong vùng 1250 cm-1 được gán cho dao động hóa trị của liên kết C-H và liên kết S=O tương ứng. Trong vùng tần số 800–940 cm-1 cho thấy sự xuất hiện các peak đặc trưng cho -carrageenan là peak 930 cm-1 liên quan đến vòng 3,6 - anhydrogalactose và peak 850 cm-1 liên quan đến dao động nhóm sulfate axial tại vị trí C4 của liên kết D-galactose [99].
Bảng 3.10. Kết quả phân tích phổ hồng ngoại của các mẫu sulfate polysaccharide trong vùng 800-1250 cm-1 Tần số cm-1 Dạng dao động Ký hiệu
Mẫu sulfate polysaccharide
TN1 TN2 TN3 TN4
1240– 1260
S=O của sulfate esters ++++ ++++ +++ +++
1075– 1085 C–O của 3,6- anydrogalactose DA +++ +++ +++ +++ 970–975 Galactose G/D ++ +++ ++++ ++++ 925–935 C–O của 3,6- anydrogalactose DA + +++ +++ +++
905–907 C–O–SO4 trên C2 của 3,6-anydrogalactose
DA2S - - - +
890–900 Unsulphated β-D- galactose
G/D + ++ +++ +++
867–871 C–O–SO4 trên C6 của galactose
G/D6S + + - -
845–850 C–O–SO4 trên C4 của galactose
G4S + + ++ ++
825–830 C–O–SO4 trên C2 của galactose
G/D2S - - + +
815–825 C–O–SO4 trên C6 của galactose
G/D6S + + - -
804–808 C–O–SO4 trên C2 của 3,6-anhydrogalactose
Hình 3.7. Phổ hồng ngoại IR của mẫu TN1 (chiết tự nhiên lạnh).
Trên phổ IR của mẫu TN1 (Chiết bằng tự nhiên lạnh) (Hình 3.7) xuất hiện các tín hiệu hấp thụ tại 3418,64 cm-1 là của nhóm O-H, dải hấp thụ rộng tại 1264,34 cm-1 thuộc về các dao động hóa trị S=O của nhóm sulfate (=SO4) là đặc trưng cho các sulfate este. Dải hấp thụ ở 934,76 cm−1 xác nhận sự có mặt của 3,6 - anhydrogalactose. Dải hấp thụ tại 845,86 cm-1 khẳng định sự có mặt của nhóm sulfate tại vị trí equatorial C4 của vòng pyranose. Dải hấp thụ ở 897,93 cm−1 xác nhận có dao động β-D-galactose hay có sự hiện diện của β- carrageenan. Ngoài ra, trên phổ IR của mẫu TN1 còn xuất hiện vân phổ có cường độ nhỏ tại vùng 820 cm-1, thuộc về dao động của gốc đường galactose và dao động của liên kết C-S-O tại vị trí C6 trong vịng pyranose (γ- carrageenan).
Hình 3.8. Phổ hồng ngoại IR của mẫu TN2 (chiết tự nhiên nóng).
Phổ IR của mẫu TN2 (Chiết tự nhiên nóng) (Hình 3.8): Dải hấp thụ tại 3444,80 cm-1 là của nhóm O-H, dải hấp thụ tại 2924,93 cm-1 là đặc trưng cho các liên kết C-H. Dải hấp thụ ở 1260,09 cm−1 xác nhận sự có mặt của nhóm sulfate. Dải hấp thụ ở 931,26 cm−1 xác nhận có dao động của liên kết C-O-C hay có sự hiện diện của 3,6 - anhydrogalactose. Trên phổ hồng ngoại IR có xuất hiện tín hiệu tại 891,12 cm-1 xác nhận sự có mặt của liên kết β-D- galactose thuộc về β-carrageenan. Khác với mẫu TN1 chỉ xuất hiện vân phổ 847,34 cm-1 xác nhận sự có mặt các liên kết C-O-S tại vị trí C4 trong vịng galactopyranose mà không xuất hiện vân phổ tại vùng 820 cm-1 như mẫu TN1.
Hình 3.9. Phổ hồng ngoại IR của mẫu TN3 (chiết kiềm lạnh).
Phổ IR của mẫu TN3 (Chiết kiềm lạnh) (Hình 3.9): Xuất hiện các dải hấp thụ tại 3421,04 cm-1 và 2925,58 cm-1 xác nhận sự có mặt của các liên kết thuộc nhóm O-H, và nhóm C-H tương ứng. Dải hấp thụ tại 1261,91 cm-1
(S=O) là đặc trưng cho các sulfate este. Dải hấp thụ ở 1638,51 cm−1 xác nhận sự có mặt của các uronic acid. Dải hấp thụ tại 931,29 cm-1 khẳng định sự có mặt của gốc đường 3,6 - anhydrogalactose. Dải hấp thụ ở 891,79 cm−1 thuộc về dao động liên kết β-D-galactose thuộc về β-carrageenan. Trong vùng 850 - 800 cm-1 có xuất hiện vân phổ 848,25 cm-1 với cường độ mạnh. Kết quả này có thể khẳng định nhóm sulfate của mẫu TN3 chủ yếu liên kết tại vị trí C4 trong vịng pyrannosegalactose.
Hình 3.10. Phổ hồng ngoại IR của mẫu TN4 (chiết kiềm nóng).
Phổ IR của mẫu TN4 (Chiết kiềm nóng) (Hình 3.10): Dải hấp thụ tại 3418,35 cm-1 và 2924,53 cm-1 là của nhóm O-H và nhóm C-H. Sự có mặt của nhóm sulfate được xác nhận bới 02 vân phổ 1263,09 cm-1 với cường độ mạnh và vân phổ 1374,00 cm-1 với cường độ yếu. Dải hấp thụ ở 931,94 cm−1 xác nhận sự có mặt của gốc 3,6 - anhydrogalactose. Dải hấp thụ ở 891,72 cm−1 thuộc về dao động liên kết β-D-galactose thuộc về β-carrageenan. Dải hấp thụ ở 847,42 cm−1 xác nhận có dao động của liên kết C-O-S tại vị trí C4 trong vịng galactosepyrannose.
Phân tích phổ hồng ngoại trong vùng vân phổ 800-1250 cm-1, cho thấy phổ hồng ngoại của tất cả các mẫu đều xuất hiện 03 vân phổ có cường độ mạnh là 845–848 cm−1, 930–931 cm−1 và 1220–1226 cm−1, các vân phổ này xác nhận sự có mặt các gốc galactose-4-sulfate; 3,6-anhydrogalactose và nhóm sulfate, đây là nhóm đặc trưng cho nhóm nguyên tử có mặt trong phân tử κ-carrageenan. Điều này chứng tỏ rằng tất cả các mẫu sulfate polysaccharide đều có chứa κ-carrageenan.
Ngồi ra trên phổ IR còn xuất hiện vân phổ tại 891 cm-1 xác nhận sự có mặt của β-carrageenan [100]. Phổ hồng ngoại của các mẫu khơng có sự khác nhau về vị trí và số lượng các tín hiệu giữa các mẫu sulfate polysaccharide, tuy nhiên có sự khác nhau giữa cường độ tín hiệu của các vân phổ 930, 891 cm-1 giữa các mẫu có xử lý kiềm và khơng xử lý kiềm, có thể cho rằng có sự tồn tại của γ-carrageenan. Điều này có liên quan đến sự xuất hiện vân phổ nhỏ tại vùng 820 cm-1 trên phổ của mẫu chiết tự nhiên, liên quan đến γ- carrageenan. Như vậy, trên phổ hồng ngoại xác nhận sự có mặt của 03 loại carrageenan là κ-carrageenan, β-carrageenan và γ-carrageenan. Kết quả này tương tự các kết luận của kết quả nghiên cứu các thành phần sulfate polysaccharide được chiết bằng các phương pháp khác nhau.
3.3.2. Phân tích cấu trúc bằng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân. nhân.
Để xác nhận các kết quả thu được từ phân tích thành phần hóa học và phổ hồng ngoại, chúng tôi tiến hành đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân.
*Phổ 1H NMR của các mẫu polysaccharide.
Kết quả đo phổ 1H NMR của 04 mẫu được trình bày trên các hình 3.11; hình 3.12; hình 3.13; hình 3.14.
Hình 3.11. Phổ 1H NMR của mẫu TN1 (chiết tự nhiên lạnh). Phổ đầy đủ phía trên và phổ vùng anomeric phía dưới.
Hình 3.12. Phổ 1H NMR của mẫu TN2 (chiết tự nhiên nóng). Phổ đầy đủ phía trên và phổ vùng anomeric phía dưới.
Anomeric(5-5.7ppm)
Hình 3.13. Phổ 1H NMR của mẫu TN3 (chiết kiềm lạnh). Phổ đầy đủ phía trên và phổ vùng anomeric phía dưới.
Hình 3.14. Phổ 1H NMR của mẫu TN4 (chiết kiềm nóng). Phổ đầy đủ phía trên và phổ vùng anomeric phía dưới.
Phổ 1H NMR của tất cả các mẫu đều xuất hiện 02 cụm tín hiệu là cụm tín hiệu tại vùng trường thấp từ 5,0 đến 5,7 ppm và cụm còn lại từ 3,3 đến 4,8 ppm. Theo kết quả phân tích thành phần hóa học (bảng 3.8; bảng 3.9) và phổ hồng ngoại thì thành phần các gốc đường trong polysaccharide chỉ có 02 gốc là 3,6 - anhydrogalactose và galactose. Vì vậy chúng tơi gán cho vùng tín hiệu tại cụm vùng trường thấp thuộc về các tín hiệu anomeric và cụm cịn lại thuộc về các tín hiệu proton (H) của của vịng galactopyranose.