1.3.4.3. Tính tan
Carrageenan tan trong nước nhưng độ tan của nó phụ thuộc vào dạng, nhiệt độ, pH, nồng độ của ion và các chất tan khác. Carrageenan có các tính chất khác nhau như hịa tan trong nước lạnh, nước nóng, sữa nóng, sữa lạnh, dung dịch đường và dung dịch muối....
Nước nóng: Tất cả các kiểu carrageenan được hòa tan trong nước nóng khi nhiệt độ vượt nhiệt độ tan chảy của gel. Biên độ nhiệt hịa tan bình thường là 40º tới 70ºC. Sự hòa tan phụ thuộc vào nồng độ dung dịch và sự hiện diện của loại, cũng như số lượng cation trong cấu trúc của chúng.
Nước lạnh: Trong nước lạnh, chỉ có lambda-carrageenan và muối sodium của kappa và iota carrageenan là bị hòa tan. Muối potassium, calcium của kappa và iota carrageenan khơng hịa tan trong nước lạnh, nhưng chúng sẽ trương nở theo hàm của nồng độ và kiểu cations hiện diện cũng như nhiệt độ nước và điều kiện phân tán. Muối calcium của iota carrageenan sẽ tạo ra sol thixotropic trong nước lạnh. Kappa carrageenan có khả năng trương nở kém trong nước lạnh khi tồn tại ion K+ và Ca2+ [50, 51].
1.3.4.4. Độ nhớt
Độ nhớt của dung dịch carrageenan được xác định dưới điều kiện dung dịch khơng có khuynh hướng hình thành gel. Khi dung dịch carrageenan nóng được làm lạnh, độ nhớt sẽ tăng lên cho đến khi hình thành gel. Khi gel bắt đầu hình thành, độ nhớt bắt đầu tăng lên. Vì vậy, phương pháp đo độ nhớt của dung dịch carrageenan được xác định ở nhiệt độ cao (75ºC) để tránh sự gel hóa. Độ nhớt của carrageenans thương mại vào khoảng 5 tới 800 cps khi đo dung dịch carrageenan 1,5% ở 75ºC. Độ nhớt của các dung dịch carrageenan phụ thuộc vào nhiệt độ, dạng, trọng lượng phân tử và sự hiện diện của các ion khác trong dung dịch [52]. Khi nhiệt độ và lực ion của dung dịch tăng thì độ nhớt của dung dịch giảm. Các carrageenan tạo thành dung dịch có độ nhớt từ 25-500Mpa. Sự liên quan tỷ lệ thuận giữa độ nhớt và trọng lượng phân tử của carrageenan có thể mơ tả bằng công thức cân bằng của Mark-Houwink như sau: ( W)
a
K M
Trong đó:
:độ nhớt
W
M : trọng lượng phân tử trung bình
K và a: hằng số phụ thuộc vào dạng của carrageenan và dung mơi hịa tan.
1.3.5. Hoạt tính sinh học của carrageenan
1.3.5.1. Hoạt tính kháng virus
Carrageenan là một chất ức chế có chọn lọc một số loại virus như các virus gây bệnh ở người như virus suy giảm miễn dịch ở người (HIV), virus herpes simplex (HSV), virus cytomegalovirus và các virus khác. Carrageenan hoạt động trong hệ thống mơ hình trong ống nghiệm, chống lại các virus khác, bao gồm virus herpes simplex và một số chủng HIV-1. Tuy nhiên, giá trị IC50 in vitro đối với carrageenan ức chế virus herpes simplex và HIV-1 độ chính xác cao hơn khoảng một nghìn lần so với IC50s được quan sát để ức chế carrageenan đối với HPV trong ống nghiệm [9, 12, 54, 55, 56, 57].
1.3.5.2. Hoạt tính chống đơng máu và hạ cholesterol
Hoạt tính chống đơng máu của các mẫu thu được sau đó được nghiên cứu bằng cách sử dụng xét nghiệm PTT in vitro. Ảnh hưởng của q trình hóa học sulfate lên hoạt tính chống đơng máu đã được đánh giá, polysaccharide đã được tổng hợp, một trong số chúng tham gia vào con đường tổng hợp với chất trung gian polysaccharide amphiphilic có chứa các nhóm pivaloyl. Các carrageenan, nhóm phycocolloid của rong đỏ, đã được nghiên cứu rộng rãi về hoạt tính sinh học rộng lớn của chúng như tác dụng chống đông máu, giảm cholesterol có hoạt tính đầy hứa hẹn cả in vitro và in vivo, cho thấy tiềm năng đầy hứa hẹn được phát triển như các tác nhân điều trị [58].
1.3.5.3. Hoạt tính kháng u và điều hịa miễn dịch
Năm 1990, Noda, Hiroyuki, Amano và các cộng sự đã sàng lọc trên 46 lồi rong ở dạng bột, khơ tự nhiên trong khơng khí (trong đó có 4 lồi rong lục, 21 loài rong nâu, 21 loài rong đỏ). Hoạt tính chống ung thư biểu mơ dạng
Ehrlich được thấy rong đỏ Porphyra yezoensis (53,2%), Eucheuma gelatinae
(52,1%), bốn lồi rong đỏ có tác dụng chống ung thư dạng Meth-A fibrosarcoma [59].
Carrageenan oligosaccharides có thể ức chế đáng kể sự phát triển của sarcoma có thể cấy ghép S180. Xem xét tất cả những kết quả này, người ta cho rằng carrageenan oligosaccharides phát huy tác dụng chống khối u bằng cách thúc đẩy hệ thống miễn dịch [60].
1.3.6. Ứng dụng của carrageenan
Nhờ có các tính chất vật lý và hoá học đặc biệt của carrageenan mà carrageenan được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực thực phẩm và phi thực phẩm. Carrageenan được sử dụng như một chất keo, ổn định, làm đặc và là chất thay thế chất béo trong ngành công nghiệp thực phẩm [13, 61, 62, 63] đặc biệt là trong các sản phẩm sữa [64]. Chúng cũng như được sử dụng trong các mặt hàng phi thực phẩm như mỹ phẩm [63], dược phẩm [63]….
1.3.6.1. Trong công nghệ thực phẩm
Carrageenan được sử dụng là một chất để điều chỉnh độ chắc, trạng thái, tính chất cảm quan… Vì vậy carrageenan đóng vai trị là chất phụ gia trong thực phẩm, để tạo đông tụ, tạo tính mềm dẻo, đồng nhất cho sản phẩm và cho điểm nóng chảy thấp [13, 65].
Carrageenan được dùng:
- Trong các món ăn như: các món thạch, hạnh nhân, nước uống… - Trong quá trình sản xuất bia, những hạt κ-carrageenan đã được sử dụng để cố định tế bào nấm men (Saccharomyces sp.) [66, 67]. Sản xuất ethanol từ tinh bột theo phương pháp lên men cột kính, những hạt gel carrageenan sử dụng để cố định vi khuẩn và enzyme glucoamylase [68]. Carrageenan được bổ sung vào bia, rượu làm tăng độ trong.
- Trong sản xuất bánh mì, bánh bích quy, bánh bơng lan… carrageenan tạo cho sản phẩm có cấu trúc mềm xốp.
làm tăng độ đồng nhất, độ đặc nhất định.
- Trong sản xuất kẹo: làm tăng độ chắc, độ đặc cho sản phẩm. - Trong sản xuất phomat, sản xuất các loại mứt đông, mứt dẻo. Carrageenan được ứng dụng trong sản xuất thịt lợn đóng hộp, bổ sung vào surimi và giò chả...[69, 70].
1.3.6.2. Trong y học và dược phẩm
Carrageenan là chất nhũ hóa trong ngành dược phẩm để sản xuất các loại sản phẩm. Một nghiên cứu khác trong lĩnh vực y học của Haijn và cộng sự (2003) cho thấy carrageenan có trọng lượng phân tử 1.726 Da, khi dùng đường uống với liều 100 mg/kg ở chuột thì sự hình thành khối u bị ức chế rõ rệt [71].
Carrageenan sản xuất tetracycline và chlortetracycline [72]. Carrageenan sản xuất thuốc kháng sinh bán tổng hợp [73]. Carrageenan sản xuất acid d-aspartic [74, 75].
1.3.6.3. Trong nơng nghiệp
Carrageenan khả năng kích thích cho sự tích lũy dinh dưỡng và tái tạo lại sức sản xuất, dẫn đến sự thụ phấn cho hoa và tạo quả tốt hơn.
Carrageenan thay thế phân bón hóa học và có liên quan đáng kể đến sự nảy mầm của hạt, thúc đẩy tăng trưởng, kéo dài chồi, sản xuất hoa, phát triển rễ, ngăn chặn căng thẳng kim loại nặng và các hoạt động kháng khuẩn ở thực vật [76, 77].
1.3.6.4. Trong các ngành khác
Carrageenan là môi trường để nuôi cấy các lồi vi sinh vật, mơi trường cố định các enzyme, là chất xúc tác trong công nghiệp tổng hợp và chuyển hoá các chất khác.
Carrageenan được sử dụng như chất kết dính, chất ổn định trong kem đánh răng để chống lại sự tách lỏng. Carrageenan còn được dùng để sản xuất
các sợi nhân tạo, sơn nước, phim ảnh, giấy viết sử dụng trong dầu gội, kem dưỡng da, gel làm mát khơng khí, bọt chữa cháy và xi đánh giày…[45]
1.4. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CẤU TRÚC CARRAGEENAN CARRAGEENAN
1.4.1. Phương pháp hóa học (phân tích thành phần)
Phương pháp hóa học là phương pháp khá thơng dụng được sử dụng để xác định thành phần monome của các polysaccharide. Tính chất đặc biệt của carrageenan liên quan chủ yếu đến hàm lượng 3,6-anhydro-D-galactose và hàm lượng OSO3 có trong mạch, vì vậy việc phân tích xác định hàm lượng các thành phần này là rất quan trọng. Không giống các monome khác, 3,6- anhydro-D-galactose rất nhạy cảm với axit và bị phá huỷ hồn tồn khi thủy phân. Tính chất này được sử dụng rộng rãi để phân tích định lượng 3,6- anhydro-D-galactose khi có mặt các monome khác bằng phản ứng tạo màu với resorcinol và axit clohydric đậm đặc. Tuy nhiên, phương pháp này không phân biệt được 3,6-anhydro-D-galactose và các dẫn xuất của nó, khơng định dạng được cấu hình tuyệt đối. Để giải quyết vấn đề này người ta thường dùng các phương pháp hóa học khác nhau như axeto hóa, metanol hóa, methyl hóa, thủy phân oxi hóa, thủy phân khử rồi kết hợp phương pháp sắc ký khí… để phân tích thành phần. Mặc dù phương pháp hóa học cho những thơng tin q giá về thành phần từng cấu tử trong phân tử carrageenan nhưng phương pháp này địi hỏi nhiều quy trình phức tạp trong phịng thí nghiệm.
1.4.2. Phương pháp vật lý (Phương pháp phổ hồng ngoại, phổ cộng hưởng từ hạt nhân) hưởng từ hạt nhân)
1.4.2.1. Phương pháp phổ hồng ngoại (IR)
Đây là phương pháp vật lý được sử dụng rộng rãi trong phân tích cấu trúc nói chung và phân tích cấu trúc carrageenan nói riêng. Ưu điểm của phương pháp này là kỹ thuật sử dụng đơn giản, nhanh, mẫu không bị phá hủy và chỉ cần lượng mẫu cỡ vài miligam (mg). Phương pháp này mang đến những thông tin cấu trúc quan trọng, đặc biệt với nhóm sulfate.
Phép đo này chỉ địi hỏi một vài milligam mẫu khơ được sấy, nghiền và trộn với bột KBr theo tỷ lệ 1:10 rồi tiến hành đo mẫu. Các đặc trưng nhóm chức của một loại carrageenan được đánh giá tại các số sóng đặc trưng S=O của este sulfate tại 1240cm-1, CO của 3,6-anhydro-D-galactose tại 930-940 cm-1. C-O-S của sulfate axial thứ hai ở C-4 của galactose tại 845cm-1. C-O-S của sulfate equatorial thứ nhất ở C-6 của galactose tại 820cm-1. C-O-S của sulfate axial thứ hai ở C-2 của 3,6-anhydro-D-galactose tại 805cm-1 [78].
Dải hấp thụ tại 895-900cm-1 cũng xuất hiện trên phổ IR của một phần -carrageenan chiết tách từ Furcellaria fastigiata [78]. Dải này thường không xuất hiện trên phổ của các carrageenan khơng được đề sulfate hóa. Đây chính là điểm phân biệt giữa các carrageenan và agar. Các peak đặc trưng chính đã có thể xác định được trong rong khô ban đầu (carrageenan chiếm 50 – 70%) hoặc sau các phân đoạn chiết carrageenan. Ngay ở hàm lượng nhỏ, ở nồng độ chỉ có 5 – 7% trọng lượng cũng có thể xác định bằng cách sử dụng kỹ thuật này.
1.4.2.2. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Những năm 80 - 90 của thế kỷ 20 nghiên cứu cấu trúc đã có những thay đổi kỳ diệu khi đưa vào sử dụng phương pháp phân tích vật lý hiện đại là phương pháp NMR, nhờ đó mà những thơng tin về cấu trúc của polysaccharide có thể được biết trước khi có các sự biến đổi hóa học của chúng.
Dựa vào phổ 1H NMR của polysaccharide có thể khẳng định độ tinh khiết của mẫu (khơng có mặt của các tín hiệu các oligonucleotide, protein hay lipid) [79]. Phổ cũng có thể cho biết số monosaccharide thực từ số các cộng hưởng proton anomer thơng qua các tín hiệu trong khoảng 4,4 đến 5,8 ppm [79]. Như vậy dựa vào tỷ lệ tích phân tương đối của các cộng hưởng anomer có thể đánh giá tỷ lệ của các monosaccharide trong phân tử. Về mặt này kết quả phân tích hóa học có thể phù hợp với kết quả phân tích 1H NMR [79]. Nhìn chung, kết quả phân tích NMR là ổn định hơn so với kết quả phân tích hóa học nếu khơng muốn nói là chính xác hơn. Nhiều loại nhóm thế có thể được xác định rõ ràng hoặc ít ra sự có mặt của chúng cũng được dự đốn dựa
vào phổ 1D 1H NMR. Sau đó số lượng chính xác của các monosaccharide có thể được khẳng định chính xác nhờ vào việc khảo sát vùng anomer của phổ 2 chiều dị hạt nhân 1H-13C HSQC (để khẳng định vị trí của tín hiệu 1H anomer).
Độ dịch chuyển hóa học của proton anomer (4,4 – 5,8 ppm) được tách biệt một cách khơng hồn tồn rõ rệt khỏi các cộng hưởng 1H ở các vị trí khác (3,2 – 4,5 ppm) trong khi độ dịch chuyển 13C anomer (95 – 110 ppm) lại tách biệt rất rõ, không hề trùng chập với các cộng hưởng 13C ở các vị trí cịn lại (60 – 85ppm).
Dạng vịng (hexoza hay furanoza) và cấu hình anomer được suy ra từ các thông tin kết hợp giữa giá trị của độ dịch chuyển hóa học 1H (H cộng hưởng giữa 5,0 và 5,8 ppm trong khi H cộng hưởng trong khoảng 4,4 và 5,2 ppm) với hằng số tương tác vô hướng của C-1, H-1 (1JC-1, H-1 165-175 Hz đối với trong khi 1JC-1, H-1 158-165 Hz đối với). Tương tác dị hạt nhân liên kết
1JC-1, H-1 có thể thu được từ phổ 1H – 13C HSQC không khử tương tác.
Bảng 1.7. Độ dịch chuyển hóa học của dạng glucose và galactose từ cơ
sở dữ liệu SUGABASE [80] Monosaccharide H-1 C-1 H-2 C-2 H-3 C-3 H-4 C-4 H-5 C-5 H-6a C-6 H-6b C-6 -D-Glcp 5,1 ± 0,30 97,5 ± 4,5 3,52 ± 0,06 72,5 ± 1,0 3,76 ± 0,10 73,8 ± 0,6 3,41 ± 0,05 70,7 ± 0,6 3,74 ± 0,10 72,9 ± 0,5 3,64 ± 0,16 61,4 ± 0,4 3,78 ± 0,08 -D-Glcp 4,84 ± 0,46 102,9 ± 2,4 3,31 ± 0,05 74,1 ± 1,1 3,55 ± 0,07 76,3 ± 1,4 3,51 ± 0,13 70,4 ± 1,0 3,55 ± 0,09 76,0 ± 1,3 3,77 ± 0,05 61,5 ± 1,0 3,94 ± 0,05
-D-Galp 5,16 ± 0,35 99,1 ± 3,1 3,89 ± 0,12 68,9 ± 1,3 3,93 ± 0,16 70,2 ± 1,7 4,12 ± 0,19 68,6 ± 1,9 4,11 ± 0,29 71,0 ± 2,0 3,73 ± 0,07 61,7 ± 0,8 3,73 ± 0,04 -D-Galp 4,68 ± 0,26 103,5 ± 2,4 3,53 ± 0,17 71,7 ± 1,7 3,80 ± 0,16 73,5 ± 1,7 4,08 ± 0,18 67,9 ± 2,0 3,74 ± 0,20 75,5 ± 1,1 3,74 ± 0,05 61,8 ± 0,7 3,74 ± 0,05
Các vị trí được thế của monosaccharide được gọi là vị trí aglycon tương ứng với các nguyên tử C ở các vị trí ngồi vị trí anomer của liên kết glycoside.
Từ dữ liệu NMR, vị trí liên kết được suy ra dựa trên sự tăng mạnh (> + 3 ppm) về độ dịch chuyển hóa học của 13C so với độ dịch chuyển hóa học của các monome khống chế. Việc phân tích này cũng mang lại thông tin giống với những phân tích khi metyl hóa. Trật tự các đơn phân trong mạch của polysaccharide cũng chính là cấu trúc chuỗi của các liên kết glycoside, là thông tin cấu trúc chính cần xác định sẽ thu được từ hai loại phổ 1H-13C HMBC và NOESY.
1.4.3. Một số nghiên cứu cấu trúc của carrageenan
Năm 2003, Thành Thị Thu Thủy và cộng sự sử dụng phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR), phổ hồng ngoại (IR) và sắc ký lọc gel (GPC)/sắc ký lỏng khối phổ có bộ kết nối phun điện (ESI-MS) đã xác định được carrageenan chiết xuất từ rong sụn nuôi trồng tại tỉnh Ninh Thuận là κ-carrageenan [81].
In Guangli (2004), thủy phân κ-carrageenan bằng acid HCl chỉ xảy ra tại liên kết α-(1→3) glycosidic. Sử dụng ESI-MS, chứng minh rằng các phân tử κ-carrageenan là một acid sulfuric galactan tuyến tính, khơng tồn tại phân nhánh [82].
Theo Guibet và cộng sự (2006), các sản phẩm thủy phân được phân tích bằng phổ 1H và 13C-NMR, tất cả các oligo carrageenan quan sát thuộc loại neo - carrabiose oligosaccharide chỉ ra rằng -carrageenase thủy phân liên kết - (1-4) glycosidic [83].
Trần Đình Toại và cộng sự (2008), sử dụng acid HCl để thủy phân carrageenan chiết từ rong Hồng Vân Eucheuma gelatinae thuộc ngành rong
đỏ Rhodophyta vùng biển Việt Nam để tạo oligo carrageenan và dùng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR) và phổ khối kết hợp sắc ký lỏng ESI-MS để xác định cấu trúc của sản phẩm, đi đến kết luận quan trọng: thủy phân carrageenan bằng acid HCl làm thay đổi không đáng kể cấu trúc của polymer, chỉ có tác dụng phá vỡ các liên kết glycoside làm cắt ngắn mạch polymer [84].
Năm 2009, theo Loan Hui các oligosaccharide tách bằng cách sử dụng phân đoạn ethanol, các phân đoạn được sắc ký lọc gel qua cột lọc Bio-Gel P- 4, xác định phổ IR và phân tích hóa học, chứng minh rằng: quá trình thủy